重組hCDMP1腺病毒轉染骨髓間充質干細胞對其向軟骨分化的影響

王月田,崔 穎,潘欣宇,姚 梅,張 本,李 諶

(1.遼寧醫學院,遼寧錦州 121001;2.遼寧醫學院附屬第一醫院,遼寧錦州 121001)

重組hCDMP1腺病毒轉染骨髓間充質干細胞對其向軟骨分化的影響

王月田1,崔 穎2△,潘欣宇1,姚 梅1,張 本2,李 諶2

(1.遼寧醫學院,遼寧錦州 121001;2.遼寧醫學院附屬第一醫院,遼寧錦州 121001)

目的探討人軟骨源性形態發生蛋白1(CDMP1)基因轉染對骨髓間充質干細胞(BMSCs)增殖及分化的影響?方法

采用腺病毒轉染方法將重組人CDMP1(hCDMP1)基因轉入體外培養的兔BMSCs,用免疫印跡法(Western blot)檢測hCDMP1蛋白質的表達,并通過檢測細胞增殖能力(MTT法)?Ⅱ型膠原(ColⅡ)以及蛋白多糖的表達,分析轉染hCDMP1對BMsCs增殖?分化的影響?結果hCDMP1蛋白在基因轉染細胞內得到正確表達;hCDMP1基因轉染組和對照組相比,ColⅡ?蛋白多糖表達水平顯著增高(P0.05),而細胞增殖能力無明顯變化(P0.05)?結論外源基因轉染可以使BMSCs表達有生物活性的hCDMP1,高表達的hCDMP1可以促進BMSCs向軟骨表型分化,但對細胞增殖無明顯影響?

骨形態發生蛋白質類;骨髓;間質干細胞;軟骨發生;轉染

目前選用何種生長調節因子以及如何保證其持續高效的刺激作用在誘導骨髓間充質干細胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)向軟骨分化的研究中還處于探索階段?研究已證明轉化生長因子?骨形態發生蛋白?生長分化因子等在誘導BMSCs向軟骨分化的過程中發揮著重要的調節作用[1]?軟骨源性形態發生蛋白1(cartilage-derived morphogenetic protein 1,CDMP1)是近年來發現的一種多肽生長因子,具有特異的軟骨誘導能力,可在異位誘導形成軟骨[2]?近年來有關CDMP1對BMSCs的誘導作用的研究多數是重組因子的直接刺激作用,但細胞因子在體內代謝快,持續時間短,誘導效率低?通過基因工程技術將外源CDMP1基因導入BMSCs,使其持續?穩定?高效表達目的基因是解決上述問題的一種措施?

1 材料與方法

1.1 主要試劑 胎牛血清?L-DMEM培養基?青霉素?鏈霉素?胰蛋白酶?臺盼藍?淋巴細胞分離液?Ad-CMV-CDMP1-IRES-eGFP?Ad-CMV-eGFP?甲 基 噻 唑 基 四 唑 (methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)試劑盒?免疫組化試劑盒?Ⅱ型膠原蛋白多克隆抗體及甲苯胺藍;兔抗人CDMP1單克隆抗體由遼寧醫學院耳鼻咽喉頭頸外科實驗室提供?清潔級新西蘭白兔購自遼寧醫學院動物中心?

1.2 BMSCs的分離和培養 取1月齡左右的健康新西蘭白兔,無菌條件下分離雙側股骨,分別剪開股骨兩端,不含血清的L-DMEM沖洗骨髓腔,4號針頭反復吹打沖出的骨髓液,100目篩網過濾,參照文獻[3]進行細胞的分離和培養?

1.3 腺病毒介導重組人CDMP1轉染BMSCs

1.3.1 取第3代兔BMSCs以5×105/孔的密度接種于6孔細胞培養板,常規培養24h,待細胞貼壁后吸去上清?按照公式感染復數(multiplicity of infection,MOI)=(蝕斑形成單位/mL)×所取病毒液體積/待轉染的細胞數,取腺病毒病毒液以MOI 50?100?200?300四個值轉染 MSCs,留下2孔作為陰性對照?37℃孵育3h,換成完全培養基常規培養48～72h,熒光倒置顯微鏡下檢測增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP),以不引起明顯細胞病變效應(cytopathic effect,CPE)的最大MOI作為腺病毒的最佳MOI值?

1.3.2 實驗分組 取第3代生長狀態良好的BMSCs 9瓶,待細胞生長至約80%匯合,隨機分為3組?各種病毒液以最佳MOI值分別轉染BMSCs,48～72h在熒光倒置顯微鏡下觀察轉染效果?實驗組:轉染 Ad-CMV-hCDMP1-IRES-eGFP;對照組:轉染 Ad-CMV-eGFP;陰性組:未轉染病毒?

1.4 CDMP1基因轉染后BMSCs的增殖和分化

1.4.1 甲苯胺藍染色及免疫組化方法檢測細胞蛋白多糖基質?Ⅱ型膠原的表達 取上述3組細胞爬片(每組10張),丙酮固定,行Ⅱ型膠原免疫組化和甲苯胺藍染色?醫學圖像分析系統測定染色的吸光度?200倍鏡下切片隨機選取3個陽性視野測量吸光度,取其平均值代表該標本的蛋白表達強度?結果以±s表示?

1.4.2 MTT比色法檢測細胞增殖活力,繪制細胞生長曲線取上述3組細胞制備細胞懸液,調整細胞密度為1×105/mL,接種于96孔培養板?第1～9天每天同一時點,每組隨機選3孔,按照MTT試劑盒說明進行操作?

1.4.3 Western blot檢測hCDMP1多肽的表達 取上述3組適量細胞,用PBS洗滌3遍,以150μL裂解液裂解細胞,收集上清液,用RIPA裂解緩沖液(RIPA lysis buffer)稀釋,進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳,蛋白轉至硝酸纖維素膜上,用兔抗人CDMP1單克隆抗體標記?膜經徹底洗滌后,用過氧化物酶標記的羊抗兔IgG進行二抗標記?膜上加1mL化學發光劑及增強劑的混合液,暗室反應1min,X光膠片曝光,顯影,照相?

1.5 統計學處理 應用SPSS17.0軟件進行統計分析,采用單因素方差分析?以P0.05為差異有統計學意義?

2 結 果

2.1 細胞培養 BMSCs剛分離接種時,其內有血細胞混雜,不易分辨成分?可見貼壁細胞呈三角形?多角形或短梭形,在部分區域有細胞的小集落形成,數個至數十個不等?7d后貼壁細胞體積增大,細胞形態基本一致,呈典型的成纖維細胞形態?10～12d后貼壁細胞體逐漸增多并連接成片,呈魚群狀排列?傳代培養細胞比原代細胞成分純凈,含少量的混雜細胞?2d后大部分細胞貼壁,細胞形態較舒展,3～4d可見細胞增殖,呈典型的長梭形,細胞數明顯增加,7～8d長滿瓶底?

2.2 感染后BMSCs增殖活力的檢測 MTT比色檢測結果:實驗組細胞在第3天進入對數生長期,第6天進入平臺期,第8?9天生長開始減慢,生長曲線和對照組基本相似?實驗組吸光度(A570)值在各時點均高于對照組和陰性組,但差異無統計學意義(P=0.794)?

2.3 CDMP1基因修飾后的表達 感染后24h實驗組和對照組細胞在熒光顯微鏡下均可見到少量綠色熒光,48h明顯增多,72h可見到大量綠色熒光,熒光與細胞輪廓一致,轉染率為90%以上,持續14d以上(封2圖1)?陰性組細胞無綠色熒光?Western blot結果:實驗組出現相對分子質量約55.6×103的明顯的電泳條帶,而對照組和陰性組則未顯示(封2圖2)?

2.4 基因修飾后細胞外基質的檢測 Ⅱ型膠原免疫組化結果顯示,實驗組細胞質出現較明顯的棕色顆粒(封3圖3),而對照組和陰性組顯色較弱?甲苯胺藍染色顯示,實驗組細胞質呈深藍紫色,而對照組和陰性組顯色較弱?經計算機圖像分析,實驗組?對照組及陰性組Ⅱ型膠原表達(以積分光密度IOD表示,下同)IOD 分別為:35.17±1.07?10.32±1.01?10.24±0.90?實驗組與對照組?陰性組比較,差異有統計學意義(P0.05)?實驗組?對照組及陰性蛋白多糖表達IOD分別為:38.34±1.28?11.44±1.09?10.45±1.11?實驗組與對照組?陰性組比較,差異有統計學意義(P0.05)?

3 討 論

創傷和疾病引起的頭頸部軟骨缺損的修復是耳鼻咽喉科?頭頸外科醫師面臨的難題?軟骨組織工程為解決這一臨床難題帶來了新的思路和方法?種子細胞作為軟骨組織工程三要素之一[4],應具有:來源穩定?取材方便?體外培養增殖能力強?細胞表型穩定?耐機體免疫性高?無致瘤性等優點[5]?BMSCs是源于中胚層和外胚層的一類多能干細胞,因具有自我更新?多向分化?造血支持?促進干細胞植入和免疫調控的特點,成為目前公認的理想的種子細胞[6]?常用的分離BMSCs的方法有全骨髓培養法和密度梯度離心法?馬林祥等[7]選用全骨髓培養法和密度梯度離心法二者結合的優化方案,可以得到較純凈的BMSCs?實驗采用優化方案,經原代培養獲得BMSCs可在體外傳20代以上,在數量上能夠滿足組織工程種子細胞的需要?

CDMP1也即生長分化因子5,是轉化生子因子-β超家族的成員,也是骨形態發生蛋白家族中的新亞型[8]?CDMP1是一種分泌的信號分子,在人體骨骼的發育和增長中起關鍵作用[9],在軟骨形成的初期主要是促進間充質前軟骨細胞的黏附?聚集和分化,后期則顯著促進軟骨細胞的成熟和肥大?CDMP1基因突變或缺失導致軟骨細胞黏附?增殖能力下降,使機體在發育階段不能形成正常軟骨而致肢體畸形?

隨著組織工程和基因工程的發展,細胞治療和基因治療對損傷修復產生了深遠影響[10]?基因療法是一種控制功能蛋白質及其過程的時空表達有效的方法,可能按照一種生理性釋放調整[11]?有人用脂質體成功將hCDMP1基因轉染BMSCs并誘導成軟骨細胞,但脂質體轉染效率低?目前病毒載體是其最有效的方法,通常采用的病毒載體有腺病毒?逆轉錄病毒?腺相關病毒和單純皰疹病毒本載體,腺病毒載體對于瞬時轉染是有用的[12],但安全性尚未確定,基因表達的可控性有待提高?

本實驗采用腺病毒攜帶hCDMP1基因成功導入BMSCs,Western blot等方法證實目的基因得到了穩定表達,為以后運用該技術將hCDMP1用于基因治療提供了實驗基礎?hCDMP1基因轉染未引起BMSCs的過度增殖或抑制,保持了細胞原有的生長狀態?Ⅱ型膠原和細胞蛋白多糖是軟骨細胞的特征性標志?基因轉染后BMSCs合成細胞外基質的能力增強,實驗組Ⅱ型膠原和細胞蛋白多糖基質表達水平與對照組比較,均顯著提高,提示hCDMP1有誘導BMSCs向軟骨表型分化的作用?所以,將hCDMP1基因轉染的BMSCs用于體外構造工程化軟骨,或將其和生物降解材料相結合移植體內修復軟骨缺損,促進了基因加強軟骨工程的更大發展?

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Effects of adeno-hCDMP1 transfection on in vitro chondrogenic differentiation of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells

, ,,,
(1.,121001,;2.,121001,)

ObjectiveTo investigate the effects of gene transfaction with human cartilage-derived morphogenetic protein 1(CDMP1)on the differentiation and proliferation of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs).MethodsBMSCs were obtained from New zealand rabbits.Exogenous recombinant hCDMP1was transfected into BMSCs with adenovirus method.Then hCDMP1expression at protein level was measured by western blot method.Expression of Type 1Icollagen(ColⅡ),proteoglycan and growth of the cells were all measured by biologicalMethodsto evaluate the effects of gene transfer on the differentiation of rabbit BMSCs.ResultsAfter hCDMP1gene transfection,BMSCs expressed hCDMP1protein,and compared with the control groups,expression of proteoglycan and ColⅡincreased significantly,but no significant difference appeared in cell proliferation.ConclusionGene transfer with hCDMP1is an effective way to enhance the expression of CDMP1at protein.The expression of heterogenetic hCDMP1gene can induce BMSCs′differentiation to chondrogenic cells.But the gene transfection has no obvious effects on the proliferation of BMSCs.

bone morphogenetic proteins;bone marrow;mesenchymal stem cells;chondrogenesis;transfection

10.3969/j.issn.1671-8348.2012.16.004

A

1671-8348(2012)16-1570-02

△通訊作者,E-mail:Yingwu2002@163.com?

2011-10-12

2011-11-30)

?基礎研究?