新型八核銅配合物乳劑的體內外抗腫瘤作用*

葛蓓蕾,徐 霞,陳小讓

(鄭州大學:1.實驗動物中心;2.藥學院,鄭州 450052)

新型八核銅配合物乳劑的體內外抗腫瘤作用*

葛蓓蕾1,徐 霞2,陳小讓2

(鄭州大學:1.實驗動物中心;2.藥學院,鄭州 450052)

目的探討新型八核銅配合物乳劑(N-Cu)的體內?外抗腫瘤作用?方法 采用甲基噻唑基四唑(MTT)法檢測不同濃度N-Cu對HT29?HeLa?SGC7901和EC9706腫瘤細胞增殖的影響?利用S180腹水瘤小鼠模型觀察不同濃度N-Cu的體內抗腫瘤作用?采用流式細胞儀測定不同濃度N-Cu對S180細胞周期的影響?結果N-Cu作用4種腫瘤細胞24h后,細胞增殖均受到了不同程度的抑制,且呈濃度依賴性?N-Cu對荷S180小鼠的腫瘤生長有明顯的抑制作用?N-Cu能使G0/G1期細胞明顯增多,S期細胞減少,細胞被阻滯于G0/G1期,差異具有統計學意義(P0.05)?結論N-Cu在體內?外具有抗腫瘤作用?

抗腫瘤藥;細胞周期;腫瘤細胞,培養的;小鼠;八核銅配合物

惡性腫瘤是危害人類健康的嚴重疾病之一?隨著對腫瘤形成機制研究的深入,化療在腫瘤的治療中日益重要?由于傳統的抗腫瘤藥價格昂貴,且對機體均有明顯的毒副作用[1],因此,研究開發廉價?低毒的抗腫瘤藥物已成為當前面臨的迫切問題?本實驗所用的新型八核銅配合物乳劑(new eight-copper complex emulsion,N-Cu)是由鄭州大學化學系無機教研室合成的新型銅配合物的納米材料,具有特殊的雙螺旋結構?它是以抗高血壓藥替米沙坦為配體,和8個銅離子配合在一起的相對分子質量為8 723的大分子化合物?它在甲醇?乙醇中的溶解 度 很 小,在 二 甲 基 甲 酰 胺 (N,N-dimethylformamide,DMF)?二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)?乙腈?二氯甲烷中溶解度較大?用一定比例的DMSO促溶后,溶解在0.1mmol/L Tris-HCl中 比 較 穩 定,該 溶 液 在 238nm 和296nm處有較大的吸收度,可以用紫外分光光度法定量?

本組在進行了急性毒性研究的基礎上,對N-Cu的體內外抗腫瘤作用進行了研究,目的在于探討將其開發成為廉價?低毒的抗腫瘤藥物的可能性?

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 供試品與試劑 N-Cu為化學合成物,相對分子質量為8 723,由鄭州大學化學系無機教研室合成提供;順鉑(5mg/mL)注射液(DDP),云南生物谷燈盞花藥業有限公司提供,批號:20081203;細胞周期檢測試劑盒為南京凱基生物科技有限公司產品,批號:KGA511?

1.1.2 實驗細胞株及動物 本實驗所用細胞株分別為人結腸癌細胞HT29?人宮頸癌細胞HeLa?人胃癌細胞SGC7901和人食管癌細胞EC9706,均為貼壁生長的細胞購自中國科學院上海細胞生物研究所,在鄭州大學藥學院長期傳代培養?小鼠S180腹水瘤細胞,引自中國科學院上海細胞生物研究所,在鄭州大學實驗動物中心傳代保存?無特定病原體級昆明種小鼠90只,體質量(20.0±2.0)g,雌性,由河南省實驗動物中心提供,動物生產合格證號:SCXK(豫)2005-0001?普通環境條件下進行該實驗,溫度20～22℃,相對濕度45%～50%,自由進食和飲水[2]?

1.1.3 實驗儀器 電子天平,德國賽多利斯有限公司,BP211D型;離心機,上海安亭科學儀器廠,TDL80-2B型;倒置顯微鏡,日本Olympus公司,BH-2型;CO2培養箱,德國 Hereaus公司生產,W1-TS606/2-I型;醫用凈化工作臺,蘇州市馮氏實驗動物設備有限公司,CJ-2F型;酶標儀,DYNEX技術有限公司,ISPA-0045型;流式細胞儀,美國Coulter公司,EPICXU型?為100.00?50.00?25.00?10.00?5.00μg/mL;實驗陽性對照組用順鉑濃度為5.00μg/mL,陰性對照選用空白乳劑,

1.2 實驗方法

1.2.1 甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法測定N-Cu對腫瘤細胞增殖的影響[3-6]取對數生長期的HT29?HeLa?SGC7901?EC9706細胞,制成單細胞懸液,接種于96孔培養板內,每孔200μL;待細胞貼壁后,實驗組加不同濃度N-Cu溶液200μL/孔,使終濃度分別空白對照用DMSO,每組?設6個平行復孔?置5%CO2培養箱內分別培養24h后,每孔加入20μL濃度為5mg/mL的 MTT;繼續培養4h后棄全部上清液,每孔加DMSO 200μL,37℃震蕩孵育10min;用酶標儀檢測490nm處的吸光度(absorbance,A)值?抑制率計算公式:抑制率(%)=(對照組A490-加藥組A490)∕對照組A490×100%?采用半數抑制濃度(inhibitory concentration 50,IC50)計算軟件計算IC50,以上實驗重復3次?

表1 N-Cu對腫瘤細胞增殖的抑制率(±s,%,n=3,24h)

表1 N-Cu對腫瘤細胞增殖的抑制率(±s,%,n=3,24h)

抑制率DDP 5.00(陽性對照)藥物濃度(μg/mL) HT29抑制率 HeLa抑制率 SGC7901抑制率 EC9706 10.70±2.41 3.88±0.37 4.42±0.09 15.44±1.47 N-Cu 5.00 5.26±1.77 6.52±1.18 5.68±3.11 10.20±1.06 10.00 21.43±0.42 9.45±0.58 10.46±2.04 23.50±0.99 25.00 48.07±2.31 56.29±0.06 22.29±0.71 37.82±2.22 50.00 78.50±4.00 86.57±1.89 66.57±1.45 59.68±0.55 100.00 86.80±0.84 91.01±3.01 77.13±0.21 74.03±4.86

1.2.2 N-Cu對荷S180腹水瘤小鼠的體內抑瘤實驗 選擇接種S180腹水瘤后6～8d的健康小鼠,無菌條件下抽吸腹水,用生理鹽水1∶3稀釋后,倒置顯微鏡下計數活細胞,調整其濃度至1×107個/mL[7],用75%乙醇消毒小鼠腹腔外表面,以0.5mL/只(含腹水瘤細胞5×106個)[8]接種到腹腔?接種次日,稱量每只小鼠的體質量后,隨機分成生理鹽水陰性對照組?溶劑對照組?順鉑陽性對照組及 N-Cu高(0.80mg/mL)?中(0.40mg/mL)?低(0.20mg/mL)濃度組?每組15只?S180腹水瘤模型建立24h后,尾靜脈注射不同濃度N-Cu 0.2mL/10g治療,每日1次,連續給藥7d?用藥期間每隔一天稱量小鼠的體質量并記錄?第7天給藥后24h,每組隨機挑取5只小鼠,抽取全部腹水,測量腹水體積?停藥次日將每組剩余的10只小鼠正常飼養,每日觀察小鼠的狀況并記錄死亡時間,計算存活天數(存活超過30d的按30d計算)及生命延長率[9]?

生命延長率(%)=(治療組平均存活天數/對照組平均存活天數-1)×100%?

1.2.3 流式細胞儀檢測N-Cu對S180細胞周期的影響 第7天給藥后24h,每組隨機抽取5只動物的瘤液,混合后留取1 mL?取留取的腹水細胞置入培養液(含10%胎牛血清?青霉素100μg/mL及鏈霉素100μg/mL)中37℃培養?等到細胞生長到對數生長期時,用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)沖洗并加入0.25%的胰酶適量消化[10],吹打使團塊細胞分離,細胞分布均勻,制成單細胞懸液?置入離心管離心后待測定?

1.3 統計學處理

應用SPSS13.0統計軟件進行統計分析,數據以±s表示?組間樣本均數比較采用單因素方差分析?檢驗水準α=0.05?

2 結 果

2.1 N-Cu體外實驗 N-Cu分別作用于4種腫瘤細胞24h后,細胞增殖均受到了不同程度的抑制?且在藥物濃度為100.00μg/mL時,抑制率都達到了70%以上,其中,對 HeLa細胞的抑制作用最明顯,高達91.01%?在5～100μg/mL實驗濃度范圍內呈劑量依賴性,作用時間在24h內抑制率上升?見表1?N-Cu對4種腫瘤細胞增殖的IC50值均小于35.00μg/mL,其中對HeLa細胞作用的IC50最小,對SGC7901細胞作用的IC50最大?見表2?

2.2 N-Cu體內實驗 體內實驗結果表明,N-Cu各劑量組小鼠平均體質量與對照組比較,差異均無統計學意義;N-Cu各劑量組腹水體積與生理鹽水組相比,差異均有統計學意義(P0.05),各用藥組與生理鹽水組相比,生命延長率差異均有統計學意義(P0.05)?結果見表3～5?

表2 N-Cu對不同腫瘤細胞增殖的IC50(±s,μg/mL,n=3,24h)

表2 N-Cu對不同腫瘤細胞增殖的IC50(±s,μg/mL,n=3,24h)

腫瘤細胞 IC50(μg/mL)HT29 23.50±0.32 HeLa 17.50±0.02 SGC7901 34.50±1.04 EC9706 31.95±0.51

表3 N-Cu對荷瘤小鼠體質量的影響(n=15,±s)

表3 N-Cu對荷瘤小鼠體質量的影響(n=15,±s)

組別 濃度(mg/mL)動物體質量(g)1d 3d 5d 7d生理鹽水組 0.90 19.78±0.41 20.45±1.11 22.06±1.26 21.28±0.85乳劑對照組 0.50 19.66±0.81 21.90±0.74 22.18±1.11 23.91±1.34順鉑組 0.02 20.02±1.22 19.63±0.75 20.20±2.01 19.66±1.84低劑量組 0.20 20.32±0.47 21.18±0.62 21.71±1.30 23.30±0.91中劑量組 0.40 20.12±0.59 20.69±0.96 22.85±1.27 23.92±1.46高劑量組 0.80 20.02±0.59 21.08±1.14 23.78±1.16 24.88±1.77

表4 N-Cu對荷瘤小鼠腹水量的影響(n=5,±s)

表4 N-Cu對荷瘤小鼠腹水量的影響(n=5,±s)

與生理鹽水組相比,*:P0.05?

組別 濃度(mg/mL) 平均腹水量(mL)生理鹽水組0.90 3.15±1.12乳劑對照組 0.50 2.94±0.95順鉑組 0.02 1.76±0.47低劑量組 0.20 2.28±0.16*中劑量組 0.40 2.03±0.82*高劑量組 0.80 1.43±0.55*

表5 N-Cu對荷瘤小鼠生命延長率的影響(n=10,±s)

表5 N-Cu對荷瘤小鼠生命延長率的影響(n=10,±s)

注:與生理鹽水組相比,*P0.05?

組別 平均存活日期(d) 生命延長率(%)生理鹽水組14.2±3.2乳劑對照組 15.4±4.1 8.5±1.78順鉑對照組 21.6±2.9 52.1±0.45低劑量組 16.9±3.6 19.0±1.30*中劑量組 19.2±4.4 35.2±1.85*高劑量組 21.2±3.7 49.3±1.60*

2.3 流式細胞儀檢測N-Cu對S180細胞周期的影響 N-Cu能明顯抑制S180細胞周期的變化,使G0/G1期細胞明顯增多,S期細胞減少,但對S180細胞增殖周期G2/M期細胞作用不明顯,其中,高劑量組作用最明顯,G0/G1期細胞達到76.1%,中劑量組達到72.3%,差異具有統計學意義(P0.05)?結果見表6和圖1?

表6 N-Cu對S180細胞周期的影響(±s,%,n=3)

表6 N-Cu對S180細胞周期的影響(±s,%,n=3)

*:P0.05,與生理鹽水組相比?

組別 G0/G1期 S期 G2/M期生理鹽水組48.7±1.6 38.7±0.7 12.5±0.9乳劑對照組 48.6±1.2 35.9±0.5 15.5±0.3低劑量組 50.1±1.8 37.6±0.6 12.3±1.0中劑量組 72.3±1.1* 13.6±1.5* 14.1±0.8高劑量組 76.1±0.9* 12.7±1.2*11.2±0.8

圖1 N-Cu作用S180 24h后的流式細胞周期圖

3 討 論

隨著組織培養方法的發展,采用體外培養的癌細胞進行抗癌新藥的篩選已成為重要的手段?目前抗腫瘤藥物體外篩選的常用實驗方法主要有MTT比色分析法?硫化羅丹明法(sulforhodamine B,SRB)法?3H-TdR 摻入法?CCK-8法等[11],其中,MTT比色法快速簡便?應用廣泛,是目前各實驗室最常用的體外篩選方法?本實驗 MTT結果表明,N-Cu在體外對4種腫瘤細胞的增殖都有抑制作用,且在5～100μg/mL實驗濃度范圍內呈劑量依賴性關系,尤其對HeLa細胞的抑制作用最強,增殖抑制率高達91.01%,其IC50值最小;對SGC7901細胞作用的IC50最大,即4種細胞中,對HeLa細胞最為敏感?

動物移植性腫瘤具有成活率高,且可以同時提供大量的腫瘤模型的特點,應用也比較廣泛?本組動物實驗結果表明,NCu對荷瘤小鼠自身的生長無明顯的抑制作用,對腫瘤細胞的生長有明顯的抑制作用,與對照組相比,中高劑量組的平均腹水量顯著降低,生命延長率明顯提高,分別為35.2%和49.3%,說明N-Cu能顯著抑制腹水型S180細胞的增殖?

細胞周期(cell cycle)是指連續分裂細胞從一次有絲分裂結束到下一次有絲分裂結束所經歷的整個過程[12]?無論是正常組織細胞還是腫瘤細胞,其增殖均與細胞周期密切相關?細胞周期中的G0/G1期和G2/M期在DNA損壞因素的作用下可發生阻滯?腫瘤細胞的特點是細胞周期運行失控和不分化,細胞群體主要處于DNA合成活躍的S期;而分化的細胞群體則主要處于DNA合成靜止的G0/G1期[13]?因此,抑制細胞周期的G0/G1期的RNA及核蛋白體的合成,可間接地使腫瘤細胞的RNA合成減少[14]?本實驗細胞周期結果表明,N-Cu能明顯抑制S180細胞周期的變化,使G0/G1期細胞明顯增多,S期細胞減少?其中,高劑量組作用最明顯,G0/G1期細胞達到76.1%,中劑量組達到72.3%?

本研究結果表明,N-Cu在體內?外具有明顯的抗腫瘤活性,其作用機制及活性成分有待進一步研究?

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Study on anti-tumor effect of a new eight-copper complex emulsion in vitro and in vivo*

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(:1.;2.,,450052,)

ObjectiveTo study the anti-tumor effect of a new eight-copper complex emulsion(N-Cu)invitroandinvivo.MethodsThe effect of N-Cu on proliferation of HT29,Hela,SGC7901andEC9706cancer cell lines were evaluated by MTT reduction assay.The in vivo anti-tumor effect was examined in tumor-bearing mice.Cell cycle was determined by flow cytometry.ResultsNCu significantly inhibited the proliferation of the four tumor cell lines after 24h.With increasing drug concentration,the inhibition was significantly enhanced.TheResultsin vivo showed that N-Cu had better anti-tumor effects.N-Cu by flow cytometry showed that N-Cu with anti-S180cell proliferation,an increase in G0/G1phase and decrease in S phase.Cells were arrested in G0/G1phase.The difference was statistically significant(P0.05).ConclusionN-Cu possesses the anti-tumor effectinvivoandinvitro.

antineoplastic agents;cell cycle;tumor cells,cultured;mice;nanoporous octanuclear Cu(Ⅱ)

10.3969/j.issn.1671-8348.2012.16.003

A

1671-8348(2012)16-1567-03

* 基金項目:河南省高校科技創新人才項目(2010HASTIT016)?

2011-10-11

2011-12-23)

?綜 述?