鉤藤堿對豬冠狀動脈平滑肌舒縮作用的影響及其機制*

李鵬云,楊 艷,程 俊,劉智飛,裴 杰,周 文,曾曉榮

(瀘州醫學院心血管醫學研究所,四川瀘州 646000)

鉤藤堿對豬冠狀動脈平滑肌舒縮作用的影響及其機制*

李鵬云,楊 艷,程 俊,劉智飛,裴 杰,周 文,曾曉榮△

(瀘州醫學院心血管醫學研究所,四川瀘州 646000)

目的觀察鉤藤堿對離體豬冠狀動脈血管的作用,并探討其作用機制?方法 采用血管環張力測定技術及全細胞穿孔膜片鉗技術分別觀察鉤藤堿對離體豬冠狀動脈血管環張力的影響以及對大電導鈣激活鉀通道(BKCa)的作用?結果血管環張力實驗顯示鉤藤堿能夠明顯舒張[(89.94±1.18)%,n=7]高鉀(40mmol/L)去極化所致的冠狀動脈血管收縮,而K+通道阻斷劑四乙基胺(TEA)不能抑制鉤藤堿的舒血管作用,提示K+通道幾乎不參與鉤藤堿對豬冠狀動脈血管的舒張?在全細胞穿孔膜片鉗模式下,鉤藤堿(100μmol/L)可顯著抑制豬冠狀動脈平滑肌細胞的BKCa通道[(48.22±4.24)%,n=6],BKCa通道介導的自發性瞬時外向電流(STOCs)的幅度和頻率也分別下降了(45.74±6.26)%和(87.98±6.39)%(n=5)?結論鉤藤堿可明顯舒張豬冠狀動脈血管,而對全細胞BKCa通道具有明顯的抑制作用,K+通道的激活在鉤藤堿的舒血管機制中所起的作用不大?

鉤藤屬;鉀通道,鈣激活;肌,平滑,血管;冠狀動脈

鉤藤,性甘寒,具有清熱平肝?熄風鎮痙之功效,是著名平肝熄風代表方“天麻鉤藤飲”的主藥之一?現代藥理學研究證明鉤藤具有擴張外周血管?降壓?抑制心肌肥厚?負性肌力及負性頻率的作用[1],臨床上主要用于治療高血壓?癲癇等心腦血管和中樞神經系統疾病?中藥化學研究證明鉤藤堿是中藥鉤藤的主要有效活性成分之一[2],其藥理學活性與鉤藤近似,具有顯著的抗高血壓和神經保護作用[3]?目前采用動物模型研究表明,鉤藤堿抗高血壓效應主要與其舒血管活性相關,但鉤藤堿對冠狀動脈血管的舒縮作用及其離子通道機制的研究目前未見報道?

大電導鈣激活鉀通道(large conductance calcium-activated potassium channel,BKCa)是血管舒縮活動調節中的重要靶點?相對少量BKCa通道的激活就可造成細胞膜超極化,間接抑制L 型 電 壓 依 賴 性 鈣 通 道 (L-type voltage-dependent calcium channel,L-VDCCs)活動,從而負反饋調節平滑肌的舒張[4]?近年來的進一步研究發現,細胞內肌質網上簇集分布的蘭諾定受體(ryanodine receptors,RyRs)的協調開放激活BKCa通道產生的自發性瞬時外向電流(spontaneous transient outward currents,STOCs)是生理狀態下BKCa通道發揮負反饋調控的基礎[5]?

有研究發現在內面向外式膜片下,鉤藤堿(60μmol/L)可激活平滑肌細胞的BKCa通道[6-7]?而鉤藤堿在全細胞模式下或組織水平能否引起BKCa開放增加,目前未見報道?本研究以豬冠狀動脈為研究對象,采用血管環張力測定技術及全細胞穿孔膜片鉗技術,探討鉤藤堿對血管張力的調節,以及全細胞模式下鉤藤堿對平滑肌細胞BKCa的影響?

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 鉤藤堿(純度≥98%,中藥固體制劑制造技術國家工程研究中心提供,批號1266-070214)?清蛋白?木瓜蛋白酶?H型膠原酶?透明質酸酶?二硫蘇糖醇(dithiothreitol,DTT)?羥乙基哌嗪乙磺酸(hydroxyethyl piperazine ethanesulfonic acid,HEPES)?乙二醇四乙酸酯(ethylene glycol tetraacetate,EGTA)?四乙基胺(tetraethylammonium,TEA)?二性霉素B?蝎毒素(ibetiotoxin,IbTX)均購自Sigma公司,余為國產分析純試劑?

1.2 主要實驗溶液 臺式液:NaCl 127mmol/L,KCl 5.9 mmol/L,MgCl21.2mmol/L,CaCl22.4mmol/L,葡萄糖12.0 mmol/L,HEPES 10.0mmol/L,pH 7.4(NaOH)?無鈣臺式液除不含CaCl2外,其余成分與臺式液一致?除特殊注明外,采用以下記錄BKCa通道電流的電極內液和浴液?電極內液:K-天冬氨酸110mmol/L,KCl 30mmol/L,NaCl 10mmol/L,MgCl21mmol/L,EGTA 0.05mmol/L,HEPES 10mmol/L,二性霉 素 B 200μg/mL,pH 7.2(KOH);浴 液:NaCl 134 mmol/L,CaCl21.8mmol/L,MgCl21mmol/L,KCl 6mmol/L,葡萄糖10mmol/L,HEPES 10mmol/L,pH 7.4(NaOH)?酶液l為含0.86g/L木瓜蛋白酶?2.0g/L清蛋白?1.5g/L DTT的無鈣臺氏液;酶液2為含1.24g/L H型膠原酶?1.5g/L透明質酸酶及1.5g/L清蛋白的無鈣臺氏液?

1.3 離體豬冠狀動脈血管環張力實驗 屠宰場處死豬后,迅速取出心臟并用生理鹽水沖洗淤血,冷凍保存后立即送往實驗室?分離出左冠狀動脈前降支(內徑約1～2mm,壁厚約0.5mm),放入盛有臺氏液的器皿中,仔細剔除血管壁上的脂肪?纖維組織和外膜,注意盡量減少對組織的損傷?將分離出的冠狀動脈血管剪成長約0.5cm的血管環,浸入臺式液中4℃冰箱保存備用?實驗時,將血管環固定在通95%O2和5%CO2,37℃的恒溫浴槽中,通過張力換能器與多道生理記錄儀輸入端相連,將血管環張力傳遞至Powerlab生物信號采集處理系統?冠狀動脈血管前負荷1g,平衡60min并間隔20min更換臺式液,待基線平穩后開始實驗?標本穩定后,加入高濃度的KCl溶液,使肌槽內終濃度為40mmol/L,引起冠狀動脈環發生最大收縮,穩定10～15min?在此基礎上觀察鉤藤堿對血管張力的影響?實驗開始前所有動脈環用40mmol/L KCl多次刺激,當標本對刺激穩定時,即相鄰連續兩次同樣的刺激所引起的收縮幅度差別小于10%時,且在此基礎上10μmol/L乙酰膽堿所引起的舒張幅度小于20%,可認為內皮去除?之后用新鮮的臺式液換洗后開始正式實驗,觀察藥物干預的作用?

1.4 參照文獻[8]報道的方法?將外膜和纖維?脂肪組織剔除干凈的血管置于預冷臺式液中,縱向剖開血管后用細小的棉簽在其內膜面輕輕來回摩擦幾下以去除內皮,之后將其斜行剪成2mm×5mm的條塊?將組織塊放入酶液1,在37℃恒溫水浴箱內振蕩消化15～20min左右,將組織取出轉入酶液2中繼續消化8～10min,之后取出組織置于無鈣臺式液中用吸管輕輕吹打,吸取細胞懸液于倒置相差顯微鏡下進行觀察,如能找到4～5個細胞/低倍視野,且細胞膜完整光滑,折光性好,即可中止消化?細胞懸液于4℃保存備用?

1.5 BKCa通道電流的記錄 實驗在室溫下(20～25℃)進行,將分離所得的冠狀動脈平滑肌細胞置于倒置相差顯微鏡臺的浴槽中,將灌有電極液的微管電極固定于電極夾持器上,給予電極內一定正壓,用微電極操縱器控制微管電極浸入浴液,發放振幅l mV?波寬40ms的矩形脈沖作為參考脈沖,檢測電極尖端阻抗并觀察封接形成過程,調節放大器“V-COMP”旋鈕補償液接電位為零?操縱微推進器使電極尖端貼附在細胞表面,在示波器上可見應答電流(參考脈沖振幅)減少,稍加負壓(10～20cmH2O)即可見應答電流下降直至為零,電流噪聲隨之減小,表明高阻封接形成(阻抗高達10GΩ以上),即形成細胞貼附式膜片(cel1-attached patch)?調節C-fast進行快電容補償?在此基礎上,二性霉素B在細胞膜片上逐漸穿孔形成全細胞構型,補償串聯電阻使其最小化(一般小于10MΩ),同時調節C-slow進行慢電容補償,之后即可對細胞實行電壓鉗制?用一小的超極化電壓方波脈沖測定全細胞膜電容引起的電流瞬變:保持電位(holding potential,HP)-60mV,階躍超極化到-65mV,方波持續時間20ms,以此計算細胞膜電容(membrane capacitance,Cm)?全細胞BKCa通道電流采用階躍方波除極或斜坡除極脈沖引出?階躍方波脈沖方案:HP:-60mV,從-50mV以10mV階躍除極至+70mV,脈沖時程400ms?斜坡脈沖方案:HP:-60mV,斜坡從-80mV以0.028V/s的速度除極至+70mV?電流信號經膜片鉗放大器(CEZ-2300)放大,1kHz低通濾波,經12位 A/D?D/A轉換器(Digidata 1322A,Axon Instrument,USA),在 專 用 軟 件PCLAMP(Version 10.1,Axon Instrument,USA)支持下記錄儲存于計算機?采樣頻率為10kHz,采樣方式為Clampex下的Episodic stimulation?

1.6 統計學處理 采用SPSS11.0軟件進行統計學分析,實驗數據以±s表示,組間比較采用t檢驗,P0.05表示差異有統計學意義?

2 結 果

2.1 鉤藤堿對豬冠狀動脈血管張力的影響 平衡約1h血管張力穩定后,在恒溫浴槽中加入40mmol/L KCl,見圖1A,血管張力即刻顯著增加,張力基本穩定后在臺式液中直接加入100μmol/L鉤藤堿,觀察到KCl誘發的血管張力增加幾乎完全被抑制,20min后血管張力約下降了89.94%±1.18%(P=0.003,n=7),隨后浴槽中加入 K+通道阻斷劑10mmol/L TEA并不能抑制鉤藤堿引起的血管舒張(P=0.148,n=4);平行實驗中采用10mmol/L TEA阻斷K+通道后,鉤藤堿仍能顯著降低血管張力75.95%±13.41%(P=0.026,n=5),提示K+通道在鉤藤堿的舒張血管機制中所起的作用不大,見圖1B?

圖1 鉤藤堿對血管環張力的影響

2.2 BKCa通道的基本特性 本實驗采用二性霉素B穿孔的全細胞膜片鉗技術記錄豬冠狀動脈平滑肌細胞BKCa通道?給予小的超極化脈沖引出瞬變電流,計算出細胞膜電容為(20.74±5.58)pF(n=20)?用階躍方波及斜坡除極脈沖引出的外向電流見圖2A和2B?電流隨著膜電位的增加而增加,具有一定的外向整流特性,在較高除極電壓時電流呈現大噪聲樣特征?在觀察的2h內,記錄的電流未發現“rundown”現象?同時實驗中觀察到STOCs隨機性地疊加到全細胞BKCa電流上?BKCa通道特異性阻斷劑蝎毒素(iberiotoxin,IbTX)200nmol/L幾乎完全抑制BKCa宏觀電流及其上疊加的STOCs(n=5)(圖2B和2D)?單個STOC呈不對稱的鐘型,快速上升[上升時間=(15.02±0.89)ms],緩慢衰減[衰減時間=(31.72±1.86)ms]?圖2C顯示了在不同鉗制電壓下的全細胞STOCs圖形:當細胞膜的鉗制電壓在-60mV時,STOCs僅有少數出現;隨著細胞膜去極化程度的增大(-50～―10mV),可觀察到STOCs的幅度和頻率均明顯增加?

2.3 鉤藤堿對BKCa宏觀電流及STOCs的影響 實驗中觀察BKCa宏觀電流基本穩定后,細胞外給予鉤藤堿,使其終濃度為100μmol/L?約10min后可觀察到全細胞BKCa宏觀電流明顯減小,見圖3A?在+60mV,BKCa宏觀電流較加藥前明顯抑制了(48.22±4.24)%(P=0.024,n=6),加藥前?后記錄到的BKCa宏觀電流密度分別為(15.36±4.31)pA/pF和(7.52±1.98)pA/pF?加藥前后電流變化的電流-電壓關系曲線(I-V curves)見圖3C?同時,實驗中也觀察到鉤藤堿(100μmol/L)明顯抑制豬冠狀動脈平滑肌細胞STOCs的活性,使其幅度(Amplitude)和頻率(Frequency)分別下降了(45.74±6.26)%(P=0.018,n=5)和(87.98±6.39)%(P=0.032,n=5)?

圖2 豬冠狀動脈平滑肌細胞BKCa宏觀電流及STOCs

圖3 鉤藤堿明顯抑制豬冠狀動脈平滑肌細胞BKCa宏觀電流及STOCs

3 討 論

血管平滑肌的舒縮活動受諸多因素的影響,包括神經調節?體液調節和肌源性調節?在上述調節機制中,離子通道起著非常重要的作用?電壓依賴性鈣通道和鉀通道在調控血管舒縮活動中發揮重要的作用?Ca2+通道的抑制和K+通道的激活均可導致血管舒張[9]?其中,BKCa是血管平滑肌細胞上廣泛存在的一類K+通道,攜帶約70%～80%的外向電流,在調節冠狀動脈血流量中起著舉足輕重的作用?

血管環張力實驗表明,K+通道阻斷劑TEA不能抑制鉤藤堿的血管舒張效應,提示K+通道在鉤藤堿對豬冠狀動脈血管的舒張機制中參與的成分很少?目前已經明確,KCl引起血管收縮主要與細胞膜的去極化引起L-VDCCs開放,進而使[Ca2+]i增加觸發興奮收縮耦聯有關?因此,本組推測鉤藤堿對血管的舒張作用可能與血管平滑肌的L-VDCCs相關[3]?如已有報道在離體家兔主動脈條,鉤藤堿明顯減少KCl(40mmol/L)溶液所致的Ca2+內流量,提示鉤藤堿可能為一種鈣拮抗劑[10]?Wang等[11]研究發現鉤藤堿可直接抑制大鼠心室肌細胞的鈣通道?Zhang等[12]在血管環方面的研究也提示鉤藤堿對血管的舒張作用可能與L-VDCCs相關;另外,高濃度的鉤藤堿(>100μmol/L)可抑制咖啡因和環匹阿尼酸(cyclopiazonic acid,CPA)誘導的血管收縮?以上研究結果提示鉤藤堿的血管舒張效應主要與影響鈣轉運功能(包括外鈣內流和胞內鈣釋放)有關?

實驗中采用全細胞穿孔膜片鉗技術,首先,觀察了豬冠狀動脈平滑肌細胞BKCa及STOCs的基本特性?與以往研究結果類似[8],豬冠狀動脈平滑肌細胞的BKCa及STOCs具有明顯的電壓依賴性,兩者均可被BKCa特異性阻斷劑IbTX阻斷,從而證實STOCs是由BKCa激活產生的?其次,研究了鉤藤堿對豬冠狀動脈平滑肌細胞BKCa及STOCs的作用?實驗中發現鉤藤堿(100μmol/L)可明顯抑制全細胞BKCa及STOCs,洗脫后電流不能完全恢復?而開麗和王中峰[6]研究發現,在內面向外式膜片下,鉤藤堿可濃度依賴性地激活大鼠肺動脈平滑肌細胞的BKCa,主要通過增加BKCa的開放概率,降低通道開放時間?劉書宏等[7]也報道鉤藤堿可激活人腸系膜動脈平滑肌細胞BKCa單通道活性?研究結果的差異可能與以下幾個因素有關:(1)采用的記錄方式不同?內面向外模式主要用于研究通道的動力學特性?在此模式下記錄BKCa單通道電流時,電壓鉗制的僅是一小片細胞膜,細胞內環境已發生了很大的改變,缺少了細胞內一些信號分子及信號通路的調控?而全細胞模式下,電壓鉗制的是整個細胞膜,相對接近于細胞的生理狀態,在此模式下記錄到的BKCa電流屬于宏觀電流(macroscopical current),在一定條件下是整個細胞上BKCa通道活動形成的總和電流?(2)不同記錄模式下細胞內游離Ca2+的濃度不同,BKCa通道對Ca2+的敏感性可能也存在差異?(3)BKCa活性受到細胞內很多內源性信號分子的調控[13]?因而在全細胞模式下,鉤藤堿對BKCa活性的調節過程中是否涉及一些內源性的信號分子,還需要進一步的證實?

本實驗通過膜片鉗技術證實,鉤藤堿可明顯抑制BKCa宏觀電流?結合血管環的實驗結果表明,鉤藤堿在整體動物或組織器官水平上表現的舒張血管?降壓的作用可能主要與Ca2+通道抑制有關,進而引起細胞[Ca2+]i下降,BKCa的激活減少?然而,目前關于鉤藤堿的研究還僅僅局限于單體或有效成分,但中藥應用以復方為主,多味中藥往往協同作用,且中藥復方在體內代謝復雜,有效成分也是復雜多樣,因此,純粹單體的研究并不能很好地說明中藥復方的藥理作用機制,應用膜片鉗技術研究確切有效的中藥復方,從細胞?分子水平闡述其作用機制,為中藥復方研究開辟一條新思路,將極大地拓展中藥開發的前景?

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Mechanism of Rhynchophylline-induced relaxation in porcine coronary artery*

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(,,,,646000,)

ObjectiveTo examine the effect of rhynchophylline(Rhy)on porcine coronary artery rings and to investigate the mechanism involved.MethodsThe isometric tension of coronary arterial rings taken from porcine hearts was measured and its response to Rhy(100μmol/L)was studied.The effect of Rhy on BKCacurrents was observed by whole-cell perforated patch clamp configuration.ResultsRhy(100μmol/L)significantly antagonized[(89.94±1.18)%,n=7]the coronary artery tension increase precontracted with KCl(40mmol/L),K+channels blocker TEA(10mmol/L)failed to prevent the relaxation effect of Rhy.Under the perforated whole-cell patch-clamp configuration,Rhy(100μmol/L)significantly inhibited BKCacurrents[48.22%±4.24%,n=6].The mean amplitude and frequency of spontaneous transient outward currents(STOCs)or transient BKCacurrents were also remarkably inhibited by(45.74±6.26)%and (87.98±6.39)%(n=5),respectively.ConclusionRhy relaxes recontracted porcine coronary artery;K+channel activation is almost not involved in coronary artery relaxation induced by Rhy.

uncaria;potassium channels,calcium-activated;muscle,smooth,vascular;coronary

10.3969/j.issn.1671-8348.2012.16.001

A

1671-8348(2012)16-1561-03

* 基金項目:國家自然科學基金資助項目(30370527)?△

,Tel:0830-3160619;E-mail:zxr8818@vip.sina.com?

2011-10-07

2011-12-12)

?綜 述?