IGF-1對大鼠缺血?缺氧神經元p-JNK及p-P38表達的影響

李智勇,夏 鷹,陳曉東,羅 漢

(海南省?？谑腥嗣襻t院神經外科 570208)

IGF-1對大鼠缺血?缺氧神經元p-JNK及p-P38表達的影響

李智勇,夏 鷹,陳曉東,羅 漢

(海南省?？谑腥嗣襻t院神經外科 570208)

目的研究胰島素樣生長因子-1(IGF-1)對缺血?缺氧大鼠腦皮質神經元凋亡的保護作用及作用機制?方法 原代培養新生大鼠腦皮質神經元,建立缺血?缺氧細胞模型,觀察IGF-1及IGF-1受體抑制劑(AG1024)對該模型細胞存活率(MTT試驗)?細胞凋亡(流式細胞法)?JNK?P38表達(Western blot法)和Caspase-3活性(熒光測定法)的影響?結果IGF-1(HII組)及AG1024(HIIA組)干預細胞模型24h后,模型細胞存活率分別為(77.00±3.80)%?(62.00±4.40)%;凋亡率分別達到14.58%?24.97%?IGF-1組可明顯抑制p-JNK及p-P38的表達及Caspase-3的活性?結論IGF-1對缺血?缺氧神經元損傷有一定的保護作用,并通過調控p-JNK?p-P38及Caspase-3的表達抑制缺血?缺氧神經元的凋亡?

胰島素樣生長因子Ⅰ;缺氧缺血,腦神經元;JNK絲裂原活化蛋白激酶類;半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶

缺 氧?缺 血 性 腦 損 傷 (hypoxia-ischemic brain damage,HIBD)是圍生期新生兒腦損傷的最常見病因,重者可致永久性腦損傷,引起腦性癱瘓?智力低下等嚴重后遺癥?其發病機制至今不明,尚無特效治療,近年研究表明,與HIBD有關的神經元凋亡促進了繼發性腦損傷[1-2]?因此,發病早期抗神經細胞凋亡成為HIBD救治的關鍵?胰島素樣生長因子-1(insulinlike growth factor-1,IGF-1)是一種在體內?外均具有廣泛生物學活性的細胞因子?近年來,IGF-1對中樞神經系統損傷的保護作用研究取得了一定的進展,但IGF-1作為缺血?缺氧腦損傷保護劑的作用機制研究尚不充分[3-4]?本實驗以體外原代培養的新生大鼠腦皮層神經元建立類缺血?缺氧細胞模型,研究IGF-I對神經元缺血?缺氧損傷的保護作用,進一步探討IGF-1在HIBD病理生理過程中的調控機制?

1 材料與方法

1.1 材料 重組人胰島素樣生長因子-1(recombinant human insulin-like growth factor-1,rhIGF-1)購自Sigma公司,胰島素樣生長因子受體抑制劑(AG1024)購自Calbiochem公司,Neurobasal培養基及胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)購自Invitrogen公司,微管相關蛋白-2(microtubule associated protein-2,MAP-2)?c-Jun 氨 基 端 激 酶 (c-Jun-NH2-terminal kinase,JNK)?p-JNK?P38?p-P38 抗 體 購 自 Abcam 公 司,ApoAlert Caspase Fluorescent Assay Kit購自BD Biosciences Clontech公司?

1.2 方法

1.2.1 神經元缺血?缺氧模型的建立 在無菌條件下,取新生1dSD大鼠的大腦皮質,用Neurobasal培養基清洗,剪碎并通過40目不銹鋼篩網過篩;將組織塊置于0.25%胰蛋白酶中,振搖,37℃孵育消化10min后加FBS終止消化,過篩,濾液懸浮到Neurobasal培養基中,37℃?1 200r/min離心5min,去上清,清洗2次;沉淀加入含10%FBS的Neurobasal培養基中,輕輕吹打成單細胞懸液?將細胞懸液接種到用10μg/mL多聚-L-賴氨酸包被的細胞培養瓶中,置5%CO2培養箱中孵育,隔日半量換液一次;培養4d后,換不含10%FBS的Neurobasal培養基,將培養瓶置于低氧培養箱中,氧濃度調為1%,模擬缺血?缺氧條件培養24h?

1.2.2 實驗分組 將同批培養的大鼠皮質神經元隨機分為4組:(1)對照組(CON):正常培養皮質神經元;(2)缺氧?缺血組(HI);(3)rhIGF-1干預組(HII):于低氧培養箱內培養,無血清培養基中添加終濃度為100nmol/L的rhIGF-1,培養24h;(4)rhIGF-1與AG1024干預組(HIIA):于低氧培養箱內培養,無血清培養基中添加終濃度為100nmol/L 的rhIGF-1及10μmol/L的AG1024,培養24h?

1.2.3 免疫組織化學觀察rhIGF-1對模型細胞的影響 各組細胞干預后,棄培養液,用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)洗滌3次,4%多聚甲醛固定后進行 MAP-2免疫熒光染色?

1.2.4 rhIGF-1對模型細胞活性的影響 細胞以5×105/mL轉入96孔板,進入對數生長期后更換培養液,按實驗分組加入干預因素,孵育24h后,加入10μL甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)(5mg/mL PBS貯存液),孵育4h,吸棄培養液,加入200μL二甲基亞砜,待顆粒溶解后放在酶標儀上,在490nm波長處檢測各孔的吸光度?

1.2.5 流式細胞儀分析 采用預冷PBS沖洗留取細胞2次,重懸細胞使細胞密度為1×106/L,取100μL細胞懸液,加入5μL異硫氰酸熒光素標記的AnnexinⅤ和10μL碘化丙啶(propidium iodide,PI)混勻,室溫下避光孵育15min,每管內加入400μL結合緩沖液(1×),于1h內進行流式細胞分析?激發波長為488nm,計數104個細胞?所有數據均經Cell Qust軟件收集處理?

1.2.6 蛋白質印跡法(Western blotting)檢測 取各組細胞,棄培養液,用預冷的PBS清洗3次,100mm平皿加200μL或300μL細胞裂解液,冰面上裂解20min,15 000r/min,4℃離心10min,取上清液,Bradford法進行蛋白定量(Bio Radproteinassay)?以10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,半干電轉移法轉移至硝酸纖維素膜,室溫下用封閉液封閉2h后加入一抗(JNK?p-JNK?P38?p-P38抗體),1∶1 000稀釋,4℃孵育過夜,抗兔IgG二抗(1∶1 000稀釋)反應2h,化學發光法顯色,X射線底片曝光?實驗重復3次,β-actin作為內參照?

1.2.7 Caspase-3蛋白活性檢測 分組收集細胞(2×106);用預冷的PBS洗2次后,加入Caspase-3裂解液,冰浴10min后,4℃離心(12 000r/min,10min);取上清液,用考馬斯亮藍法(Bradford法)檢測上清液中的蛋白質濃度;50μL Caspase底物于37℃?避光孵育4h;用酶標儀在405nm波長處檢測吸光度?

1.3 統計學處理 所有數據均以±s表示,應用SPSS13.0統計軟件進行分析,組間比較采用單向方差分析法檢驗,P0.05表示差異有統計學意義?

2 結 果

2.1 顯微鏡下觀察各干預組細胞生長狀態 見封3圖1?鏡下觀察發現HI組?HII組及HIIA組細胞數量較正常組明顯減少?HI組與HIIA組細胞數量比較,差異無統計學意義(P0.05)?HII組的細胞數量高于 HI組,差異有統計學意義(P0.05)?

2.2 rhIGF-1對模型細胞活性的影響 采用 MTT比色法檢測rhIGF-1對模型細胞活性的影響,rhIGF-1對模型細胞有保護作用,細胞存活率明顯升高?HI組細胞活性明顯下降,存活率為(67.83±5.28)%?使用IGF-1干預模型細胞24h后,HII組細胞的存活率達到(77.00±3.80)%?HIIA組細胞存活率為(62.00±4.40)%?實驗結果均重復6次,見圖2?

圖2 rhIGF-1對模型細胞活性的影響

2.3 rhIGF-1對模型細胞凋亡的保護作用 采用FITC-AnnexinⅤ與PI雙染流式細胞技術檢測,實驗結果顯示,HI組細胞的凋亡率為27.10%(圖3B);HII組凋亡率為14.58%(圖3C);HIIA組凋亡率為24.97%(圖3D)?流式細胞儀結果顯示,RHIGF-1對模型細胞有保護作用,能夠降低HI組細胞的凋亡率?

2.4 rhIGF-1對模型細胞JNK和P38表達的影響 本實驗采用Western blotting檢測了JNK和P38表達?結果發現,在HI組中,p-JNK 和 p-P38表 達 上 調?HII組 p-JNK 和 p-P38表達受到抑制?實驗均重復3次(見圖4)?

圖3 rhIGF-1對模型細胞凋亡的保護作用

圖4 rhIGF-1對模型細胞JNK和P38表達的影響

2.5 rhIGF-1對Caspase-3蛋白活性的影響 實驗結果顯示,與正常組相比較,HI組和 HIIA組Caspase-3活性達到(210.86±15.00)%?(203.32±34.00)%,HII組 Caspase-3活性受到抑制,結果差異具有統計學意義?實驗結果均重復6次(見圖4)?

圖5 rhIGF-1對Caspase-3蛋白活性的影響

3 討 論

近年來,實驗研究認為IGF-1對神經元缺血?缺氧具有一定的保護作用,但作用機制還未完全明確?通過MTT及免疫組化觀察發現IGF-1可增加缺血?缺氧神經元的存活率,顯現出明確的神經保護作用,這也與他人的研究結果相一致[5]?IGF-1是一種有效的神經保護劑,在成熟腦組織中有廣泛的低水平表達,它可以調節神經細胞的生長和分化,抑制細胞凋亡,對細胞受損后的恢復也有重要作用[6]?流式細胞儀檢測發現外源性給予IGF-1,可以有效抑制缺血?缺氧神經元的凋亡率,并且 Western blotting檢測證實與下調p-JNK?p-P38的表達及抑制Caspase-3的活性有關?AG1024是IGF-1受體抑制劑,可以明顯抑制IGF-1對缺血?缺氧神經元的保護作用,證實了IGF-1的神經保護作用,且該保護作用與調節JNK?P38信號途徑有關?

絲裂原活化的蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)是一類由脯氨酸介導的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,通過Ⅷ區域雙位點的磷酸化而活化,MAPK超家族包括細胞外信號調節激酶(extracellular signal regulated kinases,ERKs)?p38 MAPK(p38mitogen activated protein kinase)?JNK 和應激活化蛋白激酶(stress activated protein kinases,SAPKs)等信號轉導途徑?缺血?缺氧腦損傷可通過一系列信號途徑轉導至細胞核,啟動相關基因表達,引起神經元凋亡?有研究表明,缺血?缺氧腦損傷可激活JNK?p38信號途徑[7]?在本實驗中,發現缺血?缺氧細胞模型中,p-JNK與p38水平升高,IGF-1對其有抑制作用?同樣,在誘導細胞凋亡的分子機制中,Caspase家族起著關鍵作用,它是一組在細胞凋亡過程中起著關鍵作用的酶?Caspase為半胱氨酸天門冬氨酸蛋白,是一組具有相似的氨基酸順序和二級結構的半胱氨酸蛋白酶,與真核細胞凋亡密切相關,還參與細胞因子的成熟?細胞生長和分化?在Caspase家族成員中,Caspase-3對凋亡的進程起著決定性作用[8]?Caspase-3被認為是細胞凋亡的執行者,是蛋白酶級聯反應的關鍵環節?本次研究發現,缺血?缺氧細胞模型中Caspase-3的活性升高,說明Caspase-3參與了神經細胞的凋亡,給予IGF-1后,Caspase-3的活性有明顯改變?其可能的機制是,缺血?缺氧誘導神經元增加了p-JNK與p38的表達,從而啟動內源性途徑激活Caspase家族,致使Caspase-3活性增高,最終神經元凋亡發生,而IGF-1可干預該途徑,最終達到抑制神經元凋亡的作用?

綜上所述,盡管IGF-1抑制神經元凋亡的調控機制尚未完全闡釋清楚,可能還存在許多未知的信號途徑和調控基因在發揮作用,但隨著對IGF-1與細胞凋亡研究的不斷深入,IGF-1有可能被作為靶點為HIBD的治療開辟新的途徑?

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Influence of IGF-1 on p-JNK,p-P38 in hypoxia ischemia neurons of rat

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(,,,570208,)

ObjectiveTo investigate the anti-apoptosis protective effects of insulin-like growth factor-1(IGF-1)on hypoxia ischemia neurons of rats and its action mechanism.MethodsCortical neurons were cultured,and made hypoxia ischemia cell model.Hypoxia ischemia cells were incubated with IGF-1or AG1024to study cell viability(MTT),apoptosis(Flow cytometry),JNK and P38expression(Western blot),and Caspase-3activation(fluorometric method).ResultsHypoxia ischemia cells were exposed to IGF-1or AG1024for 24h,and MTT assay showed that the cell survival rates of IGF-1(HII group)and AG1024(HIIA group)were(77.00±3.80)%and(62.00±4.40)%,respectively.The percentage of apoptotic cells was 14.58%and 24.97%,respectively.The expression of p-JNK,p-P38and Caspase-3activation were inhibited by IGF-1.ConclusionIGF-1protects neurons against hypoxia ischemia cells injure by inhibiting the expression of p-JNK,p-P38and caspase-3activation.

insulin-like growth factorⅠ;hypoxia-ischemia,brain;neurons;JNK mitogen-activated protein kinases;caspases

10.3969/j.issn.1671-8348.2012.16.005

A

1671-8348(2012)16-1572-03

2011-10-06

2011-12-20)

?基礎研究?