鹽酸法舒地爾對大鼠腦缺血再灌注神經元形態和Bax mRNA表達的影響

李媛媛 于永強 (河北北方學院附屬第一醫院神經內科，河北 張家口 075000)

鹽酸法舒地爾對大鼠腦缺血再灌注神經元形態和Bax mRNA表達的影響

李媛媛 于永強 (河北北方學院附屬第一醫院神經內科，河北 張家口 075000)

目的 觀察鹽酸法舒地爾對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用。方法 健康雄性Wistar大鼠30只，體重220～260 g，隨機分為模型對照組、鹽酸法舒地爾治療組，每組15只。大鼠10%水合氯醛麻醉后，頸動脈栓線法造模。鹽酸法舒地爾治療組分別于栓塞前、再灌注前5 min灌胃給藥80 mg/kg;模型對照組灌胃等量麻油。各組均4 h后斷頭取腦，HE染色光鏡下觀察細胞形態，原位雜交檢測不同組別Bax mRNA，電鏡觀察鹽酸法舒地爾對大鼠腦缺血再灌注損傷神經元形態、亞細胞結構形態的影響。結果 模型對照組腦組織內血管擴張充血，結構紊亂，部分神經細胞胞體腫脹，可見中央型尼氏小體溶解，部分神經細胞核固縮，核仁縮小、甚至消失，神經膠質細胞增生，膠質細胞結節形成;而且神經細胞核雙層膜結構不清，細胞核固縮溶解，核仁消失，線粒體水腫擴張;鹽酸法舒地爾治療組血管擴張減輕、細胞核雙層結構清晰，線粒體腫脹減輕;而且治療組Bax陽性細胞平均數密度減小(P＜0.05)。結論 鹽酸法舒地爾對大鼠腦缺血再灌注損傷有一定保護作用。

腦缺血再灌注;鹽酸法舒地爾;細胞凋亡;Bax

腦血管疾病主要的病理過程是缺血缺氧，以及由此引起的缺血再灌注損傷。鹽酸法舒地爾可以抑制平滑肌收縮而擴張血管，改善和預防由多種原因引起的腦血管痙攣，改善腦缺血癥狀及伴隨的神經元損傷〔1〕。本實驗研究鹽酸法舒地爾的腦細胞保護作用。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

健康雄性Wistar大鼠30只，體重220～260 g，隨機分為模型對照組、鹽酸法舒地爾治療組，每組15只。大鼠10%水合氯醛麻醉，暴露并分離左側頸總動脈、頸外和頸內動脈，電凝頸外動脈的分支甲狀腺上動脈、咽升動脈，結扎翼腭動脈。將前端涂有硅膠脂的尼龍線經頸外動脈插入頸總動脈，插入深度約(18±0.5)mm。選擇蘇醒后左上肢屈曲，行走時向左側旋轉或左側肢體癱瘓的大鼠為栓堵成功者進行實驗，否則視為栓堵失敗，棄之。缺血90 min將栓線拉出至頸外動脈，再灌注120 min。鹽酸法舒地爾治療組分別于栓塞前、再灌注前5 min灌胃給藥鹽酸法舒地爾(商品名：川威，天津紅日醫藥有限公司)80 mg/kg;模型對照組灌胃等量麻油。

1.2 方法

各組均4 h后斷頭取腦，在腦的視交叉后和下丘腦后橫斷(冠狀面)，將腦分成前、中、后三部分，分別在前、中切面上常規中性甲醛固定，HE染色光鏡下觀察細胞形態;原位雜交檢測不同組別Bax mRNA水平，試劑盒購于武漢博士德公司，嚴格按試劑盒說明書操作。同時取部分皮質制作超薄切片，電鏡觀察神經元形態、亞細胞結構形態。選取Bax mRNA陽性表達典型區域，細胞核染成棕黃色為陽性細胞，計數10個400倍鏡下陽性細胞數，取均值。

1.3 統計學分析

采用SPSS10.0軟件進行t檢驗。

2 結果

2.1 光鏡觀察

模型對照組皮質部分神經細胞核固縮、著色加深，有些細胞核、質界限不清;血管周圍和神經元周圍水腫帶明顯增寬(由于腦組織水腫所致)，水腫帶寬度分別為(10.55±2.37)mm、(5.76±2.80)mm。鹽酸法舒地爾治療組皮質神經元大部分結構清晰、受損神經元明顯減少，血管周圍及神經元周圍水腫帶寬度分別為(4.60±1.06)mm、(3.15±1.47)mm;兩組水腫帶寬度具有統計學差異(P＜0.05)。

2.2 電鏡觀察

模型對照組：雙層膜結構不清，細胞核固縮溶解、核仁消失，線粒體水腫擴張，神經元核內異染色質增多，內質網、核糖體、線粒體等減少，血管及膠質膜水腫。鹽酸法舒地爾治療組：雙層膜結構相對清晰，細胞核固縮少見，核仁可見，神經元異染色質少，細胞器較規整，基膜相對清晰。

2.3 不同組別神經元Bax mRNA表達的變化

模型對照組皮質神經元呈棕黃色，著色深，而且陽性細胞密集，以血管周圍為主，陽性細胞數為(76±12)個/GHF。鹽酸法舒地爾治療組皮質神經元呈淺棕黃色，陽性細胞密度較模型組減低(P＜0.05)，以血管周圍為主，陽性細胞數為(45±10)個/GHF。

3 討論

多種能造成腦組織缺血缺氧的原因，均可引起缺血缺氧腦病，早期可引起腦組織神經膠質細胞增生，神經細胞急性壞死。而缺血區域側支循環建立以后或損傷腦組織血供恢復以后，由于氧自由基生成、細胞內鈣超載、一氧化氮合成、興奮性氨基酸增加、脂質過氧化、氧化應激等毒性作用觸發細胞凋亡，造成神經細胞從基因開始死亡，其中血管再通后引起的神經細胞遲發性壞死是神經系統缺血缺氧腦病最主要的危害原因〔1～3〕。并不是所有的缺血均可引起腦細胞缺血再灌注損害。常見的原因有：(1)再灌注損傷與缺血時間密切相關，再灌注損害不會發生于過長或過短的缺血時間。(2)側支循環建立時間短、建立完善者，再灌注損害不易發生。(3)缺氧可損傷線粒體、細胞色素氧化酶系統功能，而氧自由基增多、線粒體鈣超載可使超氧化物歧化酶減少，減少自由基的清除，進一步造成細胞及細胞器的損害。

腦缺血再灌注損傷可導致細胞膜、核膜及細胞器膜通透性改變，酸鈣離子進入細胞器內，造成下列危害：(1)突觸前興奮性氨基酸谷氨酸及 N-甲基-D-天門冬氨酸釋放，引起受體依賴的Ca2+內流。(2)缺血時激活磷脂酶A2，造成膜磷脂降解，游離的花生四烯酸增多。再灌注后，花生四烯酸進一步代謝成前列腺素類、白三烯類和血小板激活因子，并啟動膜脂質過氧化，形成脂性自由基，從而促進鈣受體通道興奮性氨基酸的釋放。(3)激活蛋白酶、核酸內切酶，導致微管解聚，細胞骨架破壞，從而造成神經元死亡。(4)膜蛋白質過度磷酸化、神經細胞線粒體滯留鈣作用降低、有神經細胞毒性的興奮性谷氨酸釋放增多，造成神經元遲發性死亡〔4，5〕。本實驗結果說明鹽酸法舒地爾對平滑肌的舒張作用可以減輕再灌注導致的損傷，可能通過干預促凋亡基因表達而發揮治療作用。

1 Murabayashi M，Minato M，Okuhata Y.Kinetics of serum S100B in newborns with intracranial lesions〔J〕.Pediatr Int，2008;50(1)：17-22.

2 Barks JD.Current controversies in hypothermic neuroprotection〔J〕.Semin Fetal Neonatal Med，2008;13(1)：30-4.

3 Margolin E，Gujar SK，Trobe JD.Isolated cortical visual loss with subtle brain MRI abnormalities in a case of hypoxic-ischemic encephalopathy〔J〕.J Neuropathalmol，2007;27(4)：292-6.

4 Rhodes H.Breaking down privacy and security barriers to HIE〔J〕.J AHIMA，2007;78(10)：68-9.

5 Zanelli SA，Naylor M，Dobbins N.Implementation of a Hypothermia for HIE program：2-year experience in a single NICU〔J〕.J Perinatol，2008;28(3)：171-5.

R743

A

1005-9202(2012)23-5220-02;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.23.054

李媛媛(1972-)，女，主管護師，主要從事臨床神經疾病研究。

〔2012-03-22收稿 2012-07-10修回〕

(編輯 曲 莉)