腺苷－磷酸激活的蛋白激酶與細胞增殖

張姣姣，王 怡，楊煒蓉，汪 勇，王莉娟，王鮮忠

（西南大學動物科技學院 重慶市牧草與草食家畜重點實驗室，重慶 北碚 400716）

腺苷－磷酸激活的蛋白激酶（adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK）是一種能被腺苷－磷酸（AMP）激活，主要協調代謝和能量需要的蛋白激酶［1］；當體內能量狀況發生改變時，ATP分解為ADP、AMP并激活AMPK，并通過AMPK調節糖原、膽固醇和脂肪的合成，減少ATP的利用，同時利用ADP再合成ATP為機體補充能量，以保持機體的能量平衡，這一途徑在動物生理、營養、環境和疾病過程中起著重要作用。最近的研究表明，AMPK還可以通過負調控細胞周期的進程調節細胞增殖，抑制腫瘤細胞的增殖［2］。

1 AMPK的結構特征

AMPK 是一個由α（63kD）、β（30kD）和γ（37～63kD）亞基形成的異源三聚體，存在于所有真核生物中［1］。α為催化亞基，主要負責將ATP的磷酸傳遞至靶蛋白（如糖原合成酶、心臟型和誘導型磷酸果糖－2－激酶等）。α亞基含有一個N端激酶結構域和一個C端結構域，N端和C端之間為自抑制序列（autoinhibitory domain，AI）。α亞基包括 α1和α2，α1主要分布于腎、肝、肺、心臟和腦；α2主要分布在骨骼肌、心臟和肝臟中；β亞基為調節亞基，主要調節酶活性和亞基的細胞定位。β亞基N末端含有N－異淀粉酶結構域，β亞基的中心區域有一個糖原結合域（glycogen binding domain，GBD）。β亞基有β1和β2兩種同工型，β1具有廣泛的組織分布性，而β2主要分布在骨骼肌、心臟和胰腺中。γ亞基有4個串行重復的胱硫醚β－合酶（cystathionineβ－synthase，CBS）結構域，又稱為“Bateman區”。γ亞基包括γ1、γ2和γ3三種同工型，γ1、γ2廣泛分布于各組織細胞，γ3僅在骨骼肌中高表達。

2 AMPK活性的調節

2.1 依賴AMP的激活途徑 AMPK的活性主要受細胞中 AMP/ATP比值的調控。AMP是AMPK的特異性激活劑，一方面AMP直接作用于AMPK，變構激活 AMPK，AMP能夠直接與AMPKγ亞基的Bateman區結合，引起AMPK三聚體結構改變，增加 AMPK活性［1］；另一方面，AMP與AMPK結合后成為其上游激酶（AMP－activated protein kinase kinase，AMPKK）的底物，AMPKK再通過磷酸化AMPKα亞基上的Thr－172激活AMPK。

2.2 不依賴AMP的AMPK激酶途徑 AMPK的活性還受到其上游激酶AMPKK的調節。LKB1（liver kinase B1）和 CaMKK（calmodulin－dependent protein kinase kinase）是兩個主要的 AMPKK。Sakamoto等研究小鼠肌肉組織AMPK活性發現，當控制LKB1僅表達正常水平的10%時，AMPK的磷酸化和活化顯著降低［3］。在敲除LKB1的小鼠胚胎成纖維細胞中，CaMKK能夠通過磷酸化激活AMPK［1］。

近來研究還發現了另外兩種AMPKK：轉移生長因子β－激活激酶1（transforming growth factor－b－activated kinase，TAK1）和共濟失調毛細血管擴張癥突變基因（ataxia telangiectasia mutated，ATM）［1］。

2.3 其他激活因素 除了以上因素，在骨骼肌中，AMPK可被高濃度的肌酸激活而被高濃度的磷酸肌酸抑制［1－2］。瘦素和脂聯素均能通過下丘腦－交感神經系統軸磷酸化激活 AMPK［1］。此外，5－氨基－4甲酰胺咪唑核糖核苷酸（AICAR）在細胞內磷酸化成AMP的類似物5－氨基咪唑－4甲酰胺核糖核苷，進而磷酸化激活 AMPK［4］。二甲雙胍、ONO0－、高滲應激激活 AMPK時，AMP/ATP比值沒有增加［2］。

3 AMPK調節細胞增殖的可能機制

細胞增殖的重要環節在于G1/S點的調控。G1/S調控點的中心成分是 Rb（retinoblastoma tumor suppressor protein Rb）蛋白，在通常情況下Rb蛋白處于低磷酸化狀態，與核轉錄因子E2F1結合，當Rb蛋白被上游激酶磷酸化后，釋放出E2F1，游離的E2F1進入核內結合相關基因啟動子區，使E2F1調控的基因PCNA（proliferating cell nuclear antigen）、cyclin E表達增強，促進細胞進入S期。調控Rb蛋白的上游激酶主要包括細胞周期蛋白（cyclins）、細胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin dependent kinases，CDKs）和細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子（cyclin dependent kinase inhibitors，CDKIs）。當cyclins與CDKs結合后，形成cyclins－CDKs激酶復合物，使Rb蛋白磷酸化，促進細胞增殖；當CDKIs與CDKs結合后，抑制cyclins－CDKs激酶活性，使Rb蛋白處于低磷酸化狀態，抑制細胞增殖。

3.1 AMPK通過調節p53－p21－p27軸，使細胞周期停滯 p53是一種腫瘤抑制因子，p53蛋白對細胞周期的作用是間接的，主要通過促進p21基因的轉錄，增加p21蛋白的合成間接抑制細胞周期。但也有研究認為，p53蛋白可直接與DNA復制過程中單鏈結合蛋白增殖細胞核抗原相互作用抑制DNA復制，阻止細胞分裂，使G1期停滯。近來研究發現，p53還可能通過調節miRNAs水平參與細胞增殖［5］。p21和p27都是細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子（CDKIs），幾乎能與所有的cyclins/CDKs復合物結合，抑制cyclins/CDKs激酶復合物的活性，使細胞不能通過G期。

Shariat等對膀胱癌組織進行p53、p21、p27和Rb檢測，發現這4種蛋白在判斷膀胱癌的生物學行為上具有協同作用［6］；研究胃癌組織中p53、p21、p27和Rb蛋白表達的情況也發現，p53、p21、p27和Rb蛋白表達之間在胃癌發生、發展中均呈正相關，這也就暗示了p53、p21和p27在抑制細胞增殖方面可能具有協同作用。進一步的研究發現，激活AMPK可以引起p53蛋白在Ser－15位點磷酸化而引起p53蛋白累積，進而增加CDKIs的表達量，抑制各類腫瘤細胞的增殖［5］。Rattan等的體外和體內試驗均表明，通過AICAR激活AMPK增加了p53、p21和p27的蛋白表達量，并抑制各類癌細胞的增殖［4］。

3.2 AMPK通過抑制mTOR活性來抑制細胞增殖 mTOR（mammalian target of rapamycin）是保守的絲氨酸－蘇氨酸蛋白激酶，主要調控細胞生長和細胞分化，激活的mTOR可促進其下游的核糖體S6蛋白激酶（S6K）和轉錄起始因子4E結合蛋白1（elongation factor 4binding protein，4EBP1）的表達量增加，從而調控翻譯的起始步驟，促進細胞增殖與分化。

AMPK的激活將抑制mTOR信號轉導。激活的AMPK一方面可能從多位點磷酸化GAP，經TSC1/TSC2 （tuberous sclerosis complex 1/2，TSC1/2）途徑抑制 mTOR 的活性［7］；另一方面可以通過直接磷酸化mTOR的Thr2446位點，阻止mTOR激酶催化結構域與底物的結合。此外，AMPK還可以抑制Akt磷酸化mTOR的Ser2446位點。Kimura等用AMPK的激活劑AICAR處理肉瘤病毒40感染的人類角膜上皮細胞，發現抑制了S6K的活性［8］。這些結果表明，AMPK可能通過調控mTOR影響細胞的增殖。

3.3 AMPK激活TSC1/2影響細胞增殖 腫瘤抑制復合物TSC是由TSC1和TSC2形成的二聚體，其中TSC2具有GTP酶活化蛋白（GAP）活性，可以負性調節小GTP酶Rheb（ras－homolog enriched in brain）的活化狀態，而Rheb是mTOR的激活蛋白，所以TSC2進而抑制mTOR信號通路，負調節細胞生長和蛋白合成。研究顯示，活化的AMPK作用于TSC1/TSC2，結合TSC2的C端并磷酸化其T1227和S1345位點［7］，增強TSC2的活性，進一步抑制mTOR，使蛋白質翻譯減少，抑制細胞增殖。利用酵母雙雜交的研究發現，Grb2（growth factor receptor bound protein 2）介導了AMPK的β1亞基與TSC2的相互作用，參與了AMPK對TSC2的磷酸化調控，抑制mTOR的活性［7］，這也進一步表明，AMPK可能激活TSC1/2抑制細胞增殖。

3.4 其他方式 FAS（fatty acid synthase）是脂肪酸合成過程中的限速酶，，許多腫瘤細胞中脂肪酸合成酶FAS過量表達，抑制FAS可以抑制腫瘤細胞的增殖，誘導其凋亡。而有研究表明，活化AMPK可抑制FAS基因的表達，而且肝細胞中AICAR活化AMPK可抑制FAS的mRNA豐度，從而抑制腫瘤細胞增殖［4］，這提示AMPK可能通過抑制脂肪酸的合成來抑制細胞增殖。另外，Christine等研究發現，小鼠肝臟組織中miR－122抑制不僅增加了脂肪酸的氧化，還增加了AMPK的活性［9］。miRNAs具有抑制轉錄后基因表達的作用，在細胞增殖、分化、凋亡等一系列過程中發揮重要作用。這提示AMPK有可能通過miRNAs水平影響細胞增殖。

4 結語

AMPK是機體許多生命過程的參與者，關于AMPK的研究正往更深的領域發展。AMPK能夠通過多種途徑影響細胞增殖，對AMPK調節細胞增殖的作用機制仍有待于進一步研究。如果證實AMPK可以通過影響miRNAs的表達來調控細胞增殖，這無疑將為臨床上治療腫瘤找到新的突破口。

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