姜黃素單羰基類似物的體外穩(wěn)定性研究

楊蘋，隋思博，張敏，3，梁廣，梁方，李校堃，3，*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，吉林長春130118;2.吉林省食品藥品檢驗所，吉林長春130033;3.南京理工大學(xué)，江蘇南京210094;4.溫州醫(yī)學(xué)院，浙江溫州325035;5.大連理工大學(xué)，遼寧大連116024)

姜黃素是從中藥姜黃Curcuma LongaL根莖中提取的一種黃色酸性酚類物質(zhì)，是中藥姜黃發(fā)揮藥理作用的主要活性成分，具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗腫瘤、保肝、降血脂等多種藥理作用［1-3］。近年來關(guān)于姜黃素藥理作用方面的報道較多，但其在臨床應(yīng)用方面的報道卻很少，其原因是姜黃素溶液穩(wěn)定性差，在堿性溶液中易降解［4］、溶解度低、半衰期短等藥代缺陷，限制了姜黃素在臨床上的推廣應(yīng)用;姜黃素的不穩(wěn)定是因其結(jié)構(gòu)中含有不穩(wěn)定的β-二酮基團(見圖1)。因此，我們以提高穩(wěn)定性、改善藥代缺陷為前提，以姜黃素為先導(dǎo)物，設(shè)計合成了一種去除β-二酮基團的姜黃素單羰基類似物(見圖2)。本實驗對合成的姜黃素單羰基類似物在不同條件下的降解速率常數(shù)進(jìn)行了測定，并與相同條件下的姜黃素進(jìn)行比較，對合成化合物的穩(wěn)定性進(jìn)行研究。

圖1 姜黃素的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖

圖2 姜黃素單羰基類似物A、B的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀(日本島津公司，型號:LC-20);Hypersil ODS2 C18(日本島津公司，5 μm，4.6 mm×200 mm);數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，型號:KQ-250DB);電子天平(瑞士METTLER TOLEDO公司，型號:Seven Easy);漩渦混合儀(蘇州江東精密儀器有限公司，型號:XW-80A);酸度計(瑞士METTLER TOLEDO公司，型號:AB265-S);色譜純甲醇、色譜純乙腈購自Fisher公司;1640培養(yǎng)基購自GIBICO公司;胎牛血清FBS購自Hyclone公司;人血漿取自醫(yī)院健康自愿者采血;鼠血漿取自健康SD大鼠。姜黃素對照品為國藥集團上海化學(xué)試劑公司產(chǎn)品、姜黃素單羰基類似物A 2，5-雙(2-溴苯基)環(huán)戊酮、姜黃素單羰基類似物B 1，5-雙(2-溴苯基)-1，4-戊二烯-3酮由溫州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院梁廣教授合成;其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 方法和結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備精密稱取姜黃素對照品適量，加入1%的羧甲基纖維素鈉溶液(助溶)，配制終質(zhì)量濃度為50 mg/mL的混懸液，漩渦混合，使其充分溶解，4℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 供試品溶液的制備精密稱取受測化合物A、B各適量，加入1%的羧甲基纖維素鈉溶液(助溶)，配制終質(zhì)量濃度為50 mg/mL的混懸液，漩渦混合，使其充分溶解，4℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 緩沖溶液的配制參照文獻(xiàn)中的方法［5］配制，以磷酸二氫鈉-氫氧化鈉(pH=6.0、7.0)、碳酸-氫氧化鈉(pH=8.0、9.0、10)為緩沖體系，緩沖溶液的濃度為0.1 mmol/L，pH值分別為6.00、7.00、8.00、9.00、10.00的緩沖溶液，用酸度計進(jìn)行校正。

2.4 色譜條件及色譜圖流動相姜黃素:乙腈-水(體積比45∶55)，含1%(體積分?jǐn)?shù))乙酸;姜黃素類似物:乙腈-水(體積比70∶30)，含1%(體積分?jǐn)?shù))乙酸;檢測波長:姜黃素最大吸收波長為420 nm、姜黃素類似物最大吸收波長為361 nm;體積流量:1.0 mL/min;柱溫:30℃;進(jìn)樣量為20 μL;在上述色譜條件下，進(jìn)行HPLC分析，色譜圖見圖3。

圖3 姜黃素及其單羰基類似物的HPLC圖

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線精密稱取姜黃素及受測化合物A、B適量，加入甲醇溶液溶解并定容，配制終質(zhì)量濃度為10 mg/m L的甲醇溶液，混勻，備用。分別精密吸取不同體積的姜黃素及受測化合物A、B的甲醇溶液，加入甲醇稀釋，使其終質(zhì)量濃度分別為:100 μg/mL、50 μg/mL、25 μg/mL、5 μg/mL、0.5 μg/mL、0.25 μg/mL;過濾，取20 μL進(jìn)樣，測定其色譜峰面積，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果:姜黃素的回歸方程為:Y=215.9X－22.7，r=0.999 4，在0.25～100 μg/mL范圍內(nèi)，其線性關(guān)系良好;化合物A的回歸方程為:Y=130.2X+24.6，r=0.999 2，在0.25～100μg/m L范圍內(nèi)，其線性關(guān)系良好;化合物B的回歸方程為:Y=166.3X－47.5，r=0.999 6，在0.25～100 μg/mL范圍內(nèi)，其線性關(guān)系良好。

2.6 光照實驗將配制的姜黃素溶液及受測化合物溶液分別置于不同光照條件下(室外自然光照100 000lx、室內(nèi)光照2 000lx、光照箱4 500lx)，定時取樣，處理樣品(取100 μL溶液加入900 μL的甲醇溶液定容，過濾)，20 μL進(jìn)樣，HPLC分析，分別測定其濃度，并計算出姜黃素及合成化合物A、B溶液在不同光照條件下的降解速率方程、降解速率常數(shù)k、半衰期t1/2;結(jié)果見表1，由表1可知:姜黃素及化合物溶液在室內(nèi)光照條件下最為穩(wěn)定，在光照箱中穩(wěn)定性也較好，降解較慢，但姜黃素、化合物B在室外光照的條件下，其降解速率顯著加快，而相同條件下的化合物A在室外光照條件下的穩(wěn)定性較優(yōu)于化合物B及先導(dǎo)物姜黃素。

表1 光照對姜黃素及合成化合物穩(wěn)定性的影響(n=3)

2.7 高溫試驗將配制的姜黃素溶液及受測化合物溶液分別放入40℃、60℃的恒溫水浴鍋中保溫，定時取樣，處理樣品(樣品處理方法同2.4項所述)，20 μL進(jìn)樣，HPLC分析，分別測定其濃度，并計算出姜黃素及合成化合物A、B溶液在不同溫度下的降解速率方程、降解速率常數(shù)k、半衰期t1/2;結(jié)果見表2，由表2可知:姜黃素及合成化合物在溫度為40℃的環(huán)境中最為穩(wěn)定，在溫度為60℃的環(huán)境中降解較快，半衰期最短;說明在高溫條件下對姜黃素及合成化合物的穩(wěn)定性存在一定的影響。

表2 溫度對姜黃素及合成化合物穩(wěn)定性的影響(n=3)

2.8 緩沖溶液pH對姜黃素及化合物A、B穩(wěn)定性的影響

分別精密吸取配制好的姜黃素對照品及化合物A、B 5 mmol/L的甲醇溶液20 μL，加入到980 μL的不同pH的緩沖溶液中，37℃避光放置;定時取樣，處理樣品(樣品處理方法同2.4項所述)，20 μL進(jìn)樣，HPLC分析，分別測定其濃度，計算姜黃素及化合物A、B溶液在37℃不同pH條件下的降解速率方程、降解速率常數(shù)k、半衰期t1/2。結(jié)果表明:姜黃素及化合物呈pH依賴性，隨著緩沖溶液pH的升高，其降解速率加快;半衰期明顯縮短，其中化合物A的穩(wěn)定性較強，化合物B的穩(wěn)定性較弱，合成化合物A、B在堿性溶液中的穩(wěn)定性高于相同條件下的對照品姜黃素。分析結(jié)果見表3。

2.9 不同生物介質(zhì)對姜黃素及化合物A、B穩(wěn)定性的影響

分別精密吸取配制好的姜黃素對照品及化合物A、B 5 mmol/L的甲醇溶液20 μL，加入980 μL的不同生物介質(zhì)中(0.1 mol/L pH7.0磷酸鹽溶液、1640細(xì)胞培養(yǎng)基、1640培養(yǎng)基+10%胎牛血清、鼠血漿、人血漿)，37℃避光放置;定時取樣，處理樣品(前3個生物介質(zhì)的處理方法同2.4項所述;鼠血漿及人血漿的處理方法如下:取0.1mL混合液加入0.5 mL乙酸乙酯-三氯甲烷(9∶1V/V)處理液中，漩渦混勻，分離上層有機相，重復(fù)萃取一次，合并有機相，真空干燥，殘渣加入100 μL的甲醇溶解，過濾)，取20 μL進(jìn)樣，HPLC分析，分別測定其濃度，以時間為橫坐標(biāo)，濃度為縱坐標(biāo)作圖(以0 h的峰面積為100%計算);分析結(jié)果見圖4，結(jié)果表明:姜黃素及合成物A、B溶液在0.1 mol/L pH7.0磷酸鹽溶液、無血清的1640細(xì)胞培養(yǎng)基中降解較快，在含10%胎牛血清的1640細(xì)胞培養(yǎng)基、鼠血漿、人血漿中降解較慢;在相同條件下受測化合物的降解率均低于先導(dǎo)物姜黃素。

表3 pH值對姜黃素及合成化合物穩(wěn)定性的影響(n=3)

3 討論

已有多篇文獻(xiàn)報道［6-8］姜黃素溶液穩(wěn)定性差，在臨床前、臨床研究中表現(xiàn)出來的最大不足也是其藥代學(xué)上的缺點，如半衰期短、血藥濃度低、代謝過快、生物利用度低等;本實驗研究了光照、溫度、pH值及不同生物介質(zhì)對姜黃素及合成化合物穩(wěn)定性的影響，實驗證實了姜黃素及化合物在室內(nèi)光照度為2 000lx，溫度為40℃條件下最為穩(wěn)定。

圖4 姜黃素及合成化合物在不同生物介質(zhì)中的降解曲線(n=3)

同時，實驗還證實了姜黃素單羰基類似物在溶液中呈pH依賴性，在酸性溶液及中性溶液中較為穩(wěn)定，但其在堿性溶液中極不穩(wěn)定，隨著pH值的升高，其降解速率明顯加快，半衰期縮短;同時，不同的生物介質(zhì)對其的影響也是不同的，姜黃素在0.1 mol/L pH7.0磷酸鹽溶液、無血清的1640細(xì)胞培養(yǎng)基中降解較快，在含10%胎牛血清的1640細(xì)胞培養(yǎng)基、鼠血漿、人血漿中降解較慢，說明其在體外與血漿的結(jié)合率較低，在人體內(nèi)吸收較少，而合成化合物的降解均優(yōu)于先導(dǎo)物姜黃素，其中化合物A在鼠血漿、人血漿的降解最低，在實驗1 h內(nèi)，降解約為80%，說明其與血漿的結(jié)合率較高(還未得到進(jìn)一步的證實);可能是由于化合物B與姜黃素在結(jié)構(gòu)上的類似，而使其具有與姜黃素相近的穩(wěn)定性，而化合物A可能是由于其中間連接鏈戊環(huán)產(chǎn)生位阻而使其穩(wěn)定性增加，具體的機制還有待進(jìn)一步研究。

本實驗中對合成的姜黃素單羰基類似物A、B進(jìn)行了初步的體外穩(wěn)定性實驗，在其藥理活性方面作用廣泛，如抗氧化、抗炎、抗菌等［9-15］，但合成化合物的藥理作用及其在動物體內(nèi)代謝實驗、安全性評價實驗還未得到驗證，其應(yīng)用于臨床還有很長一段路要走，希望不久的將來，姜黃素單羰基類似物可以應(yīng)用于臨床，用于疾病的治療，為人類造福!

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