正交優化超聲波法提取瓦松總黃酮工藝的研究

祝波，王亞紅

(吉林化工學院化學與制藥工程學院，吉林吉林132022)

瓦松Orostachys fimbriatus為景天科瓦松屬植物，又名流蘇瓦松，全國各地均有分布，以全草入藥。始載于《唐本草》，據《中國藥典》2010年版一部記載其味酸、性平、無毒，歸肝、肺、脾經。具有清熱解毒、止血、利濕、消腫等功效，用于吐血、鼻衄、血痢、瘧疾、痔瘡、濕疹、癰毒、疔瘡等癥［1］。現代藥理研究表明該植物具有抗癌、抗炎、抗菌、強心、抗病毒和免疫調節等作用［2］。國內外學者對瓦松屬藥用植物的化學成分及生物活性進行了一系列研究，并取得一定進展［3-4］，瓦松主要含黃酮(flavonoids)、木栓酮(friedelin)、沒食子酸(gallic acid)、齊墩果酸(oleanolic acid)、胡蘿卜苷(carrot glycoside)、尿嘧啶(uracil)等化學成分，因此用途廣泛，具有藥、食兩用價值，同時也是飼料、化妝品原料與園藝花卉［5］。筆者為研究瓦松總黃酮現代化提取工藝，充分開發利用瓦松資源，特以主要成分總黃酮為考察指標，采用正交實驗設計方法優選其最佳提取工藝條件。

1 材料與儀器

1.1 材料瓦松(購自吉林市江城大藥房，經鑒定為瓦松Orostachys fimbriatus)，粉碎過40目篩備用。蘆丁標準品(購自中國藥品生物制品檢定所;批號:100080-200707)。

1.2 試劑無水乙醇，甲醇，無水三氯化鋁，醋酸鈉，冰醋酸，以上試劑均為分析純。

1.3 主要儀器與設備超聲波藥品處理機JBT/CYCL400T/3P(D)(濟寧金百特電子有限責任公司)，紫外可見分光光度計752N(上海精密儀器有限公司)，電子天平BS-600L(上海精細科技儀器廠)，移液管(北京玻璃儀器廠)，旋轉蒸發儀RE-52A(上海亞榮生化儀器廠)，多功能粉碎機RT-08(榮聰精密科技有限公司)。

2 方法與結果

2.1 標準品溶液的制備精密稱取110℃干燥至恒質量的蘆丁標準品10.5 mg，置于50 mL量瓶中，加60%乙醇適量，超聲溶解，冷卻后定容，配制成質量濃度為0.21 mg/mL的蘆丁標準品溶液。

2.2 供試品溶液的制備稱取40目的瓦松藥材粉末5 g，置于錐形瓶中，加入60%乙醇40 mL，超聲提取(功率400 W，溫度40℃，頻率40.1 kHz，時間40 min)，過濾，濾液移入50 mL量瓶中，用60%乙醇定容，吸取1.0 mL轉移到一干燥5 mL量瓶中，用60%乙醇定溶得到供試品溶液。在提取工藝研究中，改變相應參數。

2.3 檢測波長的確定取蘆丁標準品溶液1.0 mL、供試品溶液1.0 mL于2個10 mL量瓶中，加入A1C13溶液(0.1 mol/L)1.0 mL，醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH=5.5)1.0 mL，并用60%乙醇溶液定容，搖勻，靜置20 min。用試劑作空白對照，在300～500 nm波長范圍內進行紫外測定，結果蘆丁供試品溶液和標準品溶液在416 nm處均出現最大吸收，因此，確定測定波長為416 nm。

2.4 標準曲線的繪制精密移取蘆丁標準品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL分別置于6個10 mL量瓶中，加入A1C13溶液(0.1 mol/L)1.0 m L，醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH=5.5)1.0 mL，并用60%乙醇溶液定容，搖勻，靜置20 min。用試劑作空白對照，測定416 nm波長處的吸光度。以吸光度為縱坐標，質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線，進行線性回歸［6］，得回歸方程:y=85.00 2x+0.398 9，r=0.999 6。表明蘆丁在21～126μg/mL范圍內線性關系良好。

2.5 瓦松提取液中總黃酮的測定取瓦松提取液1.0 mL于5 mL量瓶中，用相應試劑作空白對照，測定各樣品溶液在416 nm波長處的吸光度，若測定結果超出線性范圍，可先濃縮或稀釋再進行測定。把吸光度代入回歸方程求質量濃度，然后計算提取液中總黃酮的含有量以及總黃酮提取率，計算公式如下:

總黃酮質量(mg)=(C×V1×V2)/(V3×1 000)

總黃酮提取率(%)=(總黃酮質量/藥材中總黃酮的質量)×100%

C表示所測定瓦松提取液總黃酮的質量濃度(μg/mL);V1為制備供試品溶液時定容的體積(mL);V2為所得提取液的總體積(mL);V3為從提取液中移取的用于制備供試品溶液的體積(mL)。

2.6 方法學研究

2.6.1 精密度實驗對同一供試品溶液重復取樣，按2.4項、2.5項下方法測定、計算5次，RSD為0.78%，表明用該方法測定精密度良好。

2.6.2 穩定性實驗精密吸取供試品溶液1.0 mL，按2.4項下方法分別在0、20、40、60、120、180、240 min時測定吸光度，按2.5項下方法計算提取率。RSD為0.38%，顯示在4 h內樣品溶液穩定。

2.6.3 重復性實驗準確移取同一份供試品溶液，按2.4項、2.5項下方法平行測定6次、計算提取率，RSD為0.97%，表明該測定方法重復性良好。

2.6.4 加樣回收率實驗稱取已知含有量的樣品6份(質量分數8.91%)，精密加入蘆丁標準品10mg，按2.4項、2.5項下方法測定、計算，平均回收率為98.04%，RSD為0.67%。

2.7 單因素實驗

2.7.1 提取時間的影響準確稱取5份40目的瓦松藥材5 g，置于錐形瓶中，按2.2項下方法分別在20、25、30、35、40 min超聲提取，測定吸光度，計算提取率。結果表明隨著提取時間的延長，總黃酮提取率逐漸提高，提取時間超過30 min，提取率不再增大或減小。

2.7.2 固液比的影響準確稱取5份40目的瓦松藥材5 g，置于錐形瓶中，設置提取時間30 min，分別按固液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30加入60%的乙醇溶液，研究固液比對總黃酮提取率的影響。結果表明隨著固液比的增加，總黃酮提取率逐漸增大，固液比大于1∶20時，提取率增加不再明顯，基本保持原狀。

2.7.3 超聲頻率的影響準確稱取5份40目的瓦松藥材5 g，置于錐形瓶中，按固液比1∶20加入60%的乙醇溶液，設定提取時間30 min，分別在超聲頻率23.7、40.1、47.6、66.6、71.6 kHz進行超聲提取，考察超聲頻率對總黃酮提取率的影響。結果表明隨著超聲頻率的增加，總黃酮提取率先逐漸增大，后減小，頻率為47.6 kHz時，提取率最高。

2.7.4 提取溫度的影響分別稱取6份40目的瓦松藥材5 g，置于錐形瓶中，按固液比1∶20加入60%的乙醇溶液，設定超聲頻率47.6 kHz，分別在40、45、50、55、60、65℃超聲提取30 min，測定吸光度，計算提取率。結果表明總黃酮提取率先逐漸增大，后減小，50℃時提取率達到峰值。

2.8 超聲提取工藝正交實驗根據單因素實驗結果，對提取時間、固液比、超聲頻率、提取溫度4個因素進行L9(34)正交實驗，因素水平見表1，正交設計及結果見表2。

表1 正交實驗因素水平

表2 正交實驗結果

由表2直觀分析可知各因素對實驗結果影響的順序為:提取溫度＞固液比＞提取時間＞超聲頻率，最佳工藝條件為A3B2C2D1，即提取時間40 min，固液比1∶20，超聲頻率47.6 kHz，提取溫度40℃。

2.9 最佳工藝條件的驗證性實驗按最佳工藝條件提取3份各5 g瓦松粉末，測定吸光度，計算平均提取率。平均提取率為0.802%，RSD為1.65%，結果顯示優化得到的工藝條件科學合理、具有可行性。

2.10 超聲提取與常規提取法的對比研究超聲提取按2.9項的最佳提取工藝條件進行。準確稱取3份40目的瓦松藥材5 g，采用傳統熱水回流法提取瓦松總黃酮，提取時間4 h，提取溫度40℃，提取固液比1∶20，測定吸光度，計算平均提取率。平均提取率為0.356%，RSD為1.05%。結果見表3。

表3 兩種提取方法的比較

從表3實驗結果可知，超聲提取與常規熱水回流提取的最大差別表現在提取時間和提取率這兩方面。超聲提取法的總黃酮提取率比傳統提取法提高0.446%，所需時間大大縮短。

4 結論

將超聲技術應用于瓦松總黃酮的提取，能夠增加黃酮類物質的提取率。文中探討了與超聲波作用效應相關的提取時間、固液比、超聲頻率、提取溫度4個因素對黃酮提取率的影響，同時采用正交實驗優化最佳工藝條件。最佳工藝條件為提取時間40 min，固液比1∶20，超聲頻率47.6 kHz，提取溫度40℃。在這個最佳條件下黃酮提取率為0.802%。與傳統水提方法比較，超聲提取具有省時、節能、易于操作、提取率高等優點，是一種較好的瓦松總黃酮提取新工藝。

［1］鄭萬金，仲英，孫敬勇，等.瓦松的化學成分研究［J］.中草藥，2009，40(6):859-862.

［2］安琨，鄭萬金，李海波，等.瓦松化學成分的研究(Ⅱ)［J］.食品與藥品，2011，13(7):247-249.

［3］Kim H J，Lee J Y，Kim S M，et al.A new epicatechin gallate and calpain inhibitory activity from Orostachys japonicus［J］.Fitoterapia，2009，80(1):73-76.

［4］Je Ma C，Jung W J，Lee K Y，et al.Calpain inhibitory flavonoids isolated from Orostachys Japonicus［J］.J Enzyme Inhib Med Chem，2009，24(3):676-679.

［5］鄭萬金，張萍，仲英.瓦松屬植物的研究進展［J］.齊魯藥事，2008，27(3):161-163.

［6］汪明禮.回歸分析在分析化學中的應用［J］.黃山學院學報，2005(3):40-41.