頸復(fù)康顆粒中揮發(fā)油成分抗炎鎮(zhèn)痛作用及其機(jī)制研究

楊宇杰，呂英超，于海龍，耿榕徽，郭金甲，楊冬麗，鄭艷春，王春民

(1.承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所，河北省中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北承德067000;2.承德頸復(fù)康藥業(yè)集團(tuán)有限公司，河北省中藥新輔料工程技術(shù)研究中心，河北承德067000)

頸復(fù)康顆粒現(xiàn)收載于《中國(guó)藥典》2010年版(一部)，處方由羌活、川芎、葛根、秦艽、蒼術(shù)、乳香、沒藥、地龍、桃仁等二十一味中藥組成，具有活血通絡(luò)，散風(fēng)止痛功能。現(xiàn)有研究資料表明，頸復(fù)康顆粒中川芎、羌活、蒼術(shù)、乳香、沒藥等藥材中的揮發(fā)油類成分是其主要有效部位之一，具有止痛、抗炎、活血化瘀等藥理作用［1-4］。目前，頸復(fù)康顆粒中揮發(fā)油成分的藥理作用研究尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)對(duì)頸復(fù)康顆粒中揮發(fā)油成分的抗炎、鎮(zhèn)痛作用進(jìn)行了評(píng)價(jià)研究，并初步探討其作用機(jī)制，為開展頸復(fù)康顆粒的藥物作用物質(zhì)基礎(chǔ)的技術(shù)評(píng)價(jià)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物昆明種小鼠，18～22 g，天津市山川紅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司提供，許可證號(hào):SCXK(津)2009-0001。SD大鼠，160～180 g，北京華阜康生物科技股份有限公司提供，許可證號(hào):SCXK(京)2009-0004。

1.2 藥品與試劑

頸復(fù)康顆粒揮發(fā)油，承德頸復(fù)康藥業(yè)集團(tuán)有限公司提供，批號(hào)20111101。制備方法:取川芎、蒼術(shù)、乳香、沒藥、羌活五味藥材，按頸復(fù)康顆粒處方比例配藥，破碎成粗粉，回流法提取揮發(fā)油，提取率13.9 mL/kg生藥。實(shí)驗(yàn)時(shí)用1%吐溫80稀釋到各實(shí)驗(yàn)組相應(yīng)濃度給藥。

頸復(fù)康顆粒，承德頸復(fù)康藥業(yè)集團(tuán)有限公司提供，批號(hào)20111005;角叉菜膠，上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司，批號(hào):110218;白介素1(IL-1)、腫瘤壞死因子(TNF-α)、前列腺素E2(PGE2)試劑盒，上海森雄科技實(shí)業(yè)公司產(chǎn)品。

1.3 儀器YLS-6B智能熱板儀，濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司;752N紫外可見分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響［5］昆明種小鼠40只，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，隨機(jī)分為頸復(fù)康顆粒中揮發(fā)油成分組［70 g生藥/(kg·d)］、頸復(fù)康顆粒中揮發(fā)油成分組［35 g生藥/(kg·d)］，頸復(fù)康顆粒組［12 g/(kg·d)］及空白對(duì)照組，每組10只小鼠。各組連續(xù)口服給藥7 d(給藥容積0.2 mL/10 g，空白對(duì)照組給予等容積1%吐溫80)。末次給藥1 h后，各鼠右耳滴20 μL二甲苯致炎，2 h后處死動(dòng)物，剪下左右兩耳，用直徑6 mm打孔器在左右對(duì)稱部位沖下耳片，稱質(zhì)量，以左右耳片質(zhì)量差值表示炎性腫脹程度，各組腫脹抑制率=(對(duì)照組腫脹度－各組腫脹度)/對(duì)照組腫脹度，結(jié)果見表1。以下數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

如表1所示，頸復(fù)康顆粒中揮發(fā)油成分高低兩個(gè)劑量組均能顯著抑制小鼠耳腫脹。

表1 對(duì)二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響(±s，n=10)

表1 對(duì)二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響(±s，n=10)

注:與空白對(duì)照組比較，*P＜0.001;與頸復(fù)康顆粒組比較，★P＜0.05。

組別劑量/(g·kg－1)腫脹度/mg抑制率/%－7.10±0.89－頸復(fù)康顆粒組12 4.67±0.83*34.23頸復(fù)康顆粒揮發(fā)油成分高劑量組空白對(duì)照組29.58 70 4.32±1.05*39.15頸復(fù)康顆粒揮發(fā)油成分低劑量組35 5.00±1.05*

2.2 對(duì)醋酸所致小鼠腹腔毛細(xì)血管滲出的影響［6］昆明種小鼠40只，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，分組及給藥方法同前。末次給藥后30 min，每只小鼠尾靜脈注射0.5%的伊文思藍(lán)生理鹽水溶液0.2 mL，隨后立即腹腔注射0.6%醋酸溶液0.2 mL，20 min后處死小鼠，輕揉腹部30 s，5 min后剖開腹腔，用適量生理鹽水反復(fù)沖洗，并收集洗出液，濾紙濾過，并調(diào)整容積至6 mL，3 000 r/min離心15 min，取上清液，于分光光度計(jì)590 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2 對(duì)醋酸所致小鼠腹腔毛細(xì)血管滲出的影響(±s，n=10)

表2 對(duì)醋酸所致小鼠腹腔毛細(xì)血管滲出的影響(±s，n=10)

注:與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與頸復(fù)康顆粒組比較，△P＜0.05。

組別劑量/(g·kg－1)吸光度(A)抑制率/%－0.429±0.066－頸復(fù)康顆粒組12 0.347±0.048＊＊19.1頸復(fù)康顆粒揮發(fā)油成分高劑量組空白對(duì)照組12.6 70 0.330±0.052＊＊23.1頸復(fù)康顆粒揮發(fā)油成分低劑量組35 0.375±0.046*

如表2所示，頸復(fù)康顆粒中揮發(fā)油成分高低兩個(gè)劑量組小鼠腹腔毛細(xì)血管滲出液的吸光度均明顯低于空白對(duì)照組，與空白對(duì)照組比較具有顯著性差異。

2.3 對(duì)角叉菜膠所致大鼠足腫脹的影響［7］取SD大鼠32只，雌雄各半，160～180 g，隨機(jī)分成4組，每組8只，分組情況同上。按表3所示劑量每天灌胃給藥1次，連續(xù)給藥7 d。于末次給藥后30 min，在大鼠右后足皮下注射1%角叉菜膠0.1 mL致炎。分別在致炎前和致炎后0.5、1、2、4 h測(cè)量足容積，以致炎前后不同時(shí)間點(diǎn)的腫脹差值表示腫脹度。測(cè)量后處死動(dòng)物，截取右后足，稱質(zhì)量，冰浴條件下剪碎、勻漿，按所購(gòu)試劑盒的操作步驟測(cè)定IL-1、TNF-α和PGE2水平，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)。結(jié)果見表3、表4。

表3 對(duì)角叉菜膠所致大鼠足腫脹的影響(±s，n=8)

表3 對(duì)角叉菜膠所致大鼠足腫脹的影響(±s，n=8)

注:與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01，＊＊＊P＜0.001;與頸復(fù)康顆粒組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

0.5 h 1.0 h 2.0 h 4.0 h空白對(duì)照組組別(g·kg－1)0.67±0.07 0.95±0.19 1.19±0.26 0.91±0.14頸復(fù)康顆粒組12 0.41±0.16＊＊0.56±0.12＊＊＊0.76±0.15＊＊0.64±0.17＊＊頸復(fù)康顆粒揮發(fā)油成分高劑量組70 0.38±0.10＊＊＊0.61±0.16＊＊0.79±0.05＊＊0.56±0.08＊＊＊頸復(fù)康顆粒揮發(fā)油成分低劑量組35 0.49±0.07＊＊＊0.70±0.05＊＊△0.93±0.14＊△△0.69±0.09－＊＊

表4 對(duì)大鼠腫脹足中IL-1、TNF-α和PGE2水平的影響(±s，n=8)

表4 對(duì)大鼠腫脹足中IL-1、TNF-α和PGE2水平的影響(±s，n=8)

注:與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01，＊＊＊P＜0.001;與頸復(fù)康顆粒組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別劑量/(g·kg－1)IL-1/(pg·mL－1)TNF-α/(pg·mL－1)PGE2/(pg·mL－1)126.40±17.14 478.35±31.58 49.67±7.11頸復(fù)康顆粒組12 68.99±15.47＊＊＊397.02±36.84＊＊＊34.70±8.71＊＊頸復(fù)康顆粒揮發(fā)油成分高劑量組70 69.54±15.74＊＊＊384.70±31.07＊＊＊39.63±5.25＊＊頸復(fù)康顆粒揮發(fā)油成分低劑量組35 93.87±12.52＊＊＊△△443.48±33.56＊△△43.35±4.30空白對(duì)照組－＊△

如表3所示，頸復(fù)康顆粒中揮發(fā)油成分高低兩個(gè)劑量組給藥后4 h均對(duì)大鼠足腫脹有非常顯著的抑制作用，抑制作用時(shí)間較長(zhǎng)，與空白對(duì)照組比較具有顯著性差異。

如表4所示，頸復(fù)康顆粒中揮發(fā)油成分高低兩個(gè)劑量組均可明顯降低大鼠腫脹足中IL-1、TNF-α和PGE2水平，與對(duì)照組比較差異具有顯著性。

2.4 對(duì)醋酸所致小鼠扭體反應(yīng)的影響［8］昆明種小鼠40只，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，分組及給藥方法同前。末次給藥后30 min，腹腔注射0.7%的醋酸溶液0.1 mL/10 g，5 min后記錄給藥后36～45 min，46～55 min，56～65 min，66～75 min內(nèi)每只小鼠的扭體次數(shù)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，結(jié)果見表5。各組對(duì)小鼠扭體反應(yīng)的抑制率=(對(duì)照組扭體次數(shù)－各組扭體次數(shù))/對(duì)照組扭體次數(shù)。

如表5所示，頸復(fù)康顆粒中揮發(fā)油成分高低兩個(gè)劑量組均能明顯減少小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)，與空白對(duì)照組比較差異具有顯著性。

2.5 對(duì)小鼠熱板法致痛的影響［9］小鼠熱板法:實(shí)驗(yàn)時(shí)，把小鼠放到預(yù)先加熱至55℃的恒溫金屬銅板上，以舔后足為痛反應(yīng)指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均為雌性、基礎(chǔ)痛閾在30 s內(nèi)的小鼠(藥前間隔5 min測(cè)得小鼠兩次痛反應(yīng)潛伏期，以兩次的均值作為基礎(chǔ)痛閾)。痛閾提高百分率=(各組給藥后痛反應(yīng)潛伏期-給藥前痛反應(yīng)潛伏期)/給藥前痛反應(yīng)潛伏期。

昆明種小鼠40只，雌性，體質(zhì)量18～22 g，分組及給藥方法同前。末次給藥后30 min開始觀察記錄痛反應(yīng)潛伏期，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，結(jié)果見表6。

如表6所示，頸復(fù)康顆粒中揮發(fā)油成分高低兩個(gè)劑量組小鼠舔后足時(shí)間均明顯延長(zhǎng)，與空白對(duì)照組比較差異具有顯著性。

2.6 對(duì)大鼠溫浴甩尾反應(yīng)的影響［10］SD大鼠32只，雌雄各半，160～180 g，隨機(jī)分成4組，每組8只，分組及給藥情況同上。于給藥前及末次給藥后0.5、1、2、3 h分別將大鼠尾尖2 cm浸入恒溫水浴中(55±0.5)℃，記錄鼠尾自浸入水中到出現(xiàn)甩尾動(dòng)作的時(shí)間，作為甩尾潛伏期。將給藥各組的平均甩尾潛伏期與對(duì)照組平均甩尾潛伏期比較，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)。結(jié)果見表7。

表5 對(duì)小鼠扭體反應(yīng)的影響(±s，n=10)

表5 對(duì)小鼠扭體反應(yīng)的影響(±s，n=10)

注:表中()內(nèi)數(shù)字為抑制率(%);與空白對(duì)照組比較，*P＜0.001;與頸復(fù)康顆粒組比較，△P＜0.05，△△P＜0.001。

給藥后不同時(shí)間內(nèi)扭體反應(yīng)數(shù)/(次·10 min)36～45 min 46～55 min 56～65 min 66～75 min空白對(duì)照組組別給藥劑量/(g·kg－1)－51.5±6.45 42.4±5.21 38.4±3.86 32.0±4.29頸復(fù)康顆粒組12 28.3±3.37*(45.0)14.0±4.27*(56.3)頸復(fù)康顆粒揮發(fā)油成分高劑量組70 29.7±3.59*(42.3)18.8±3.55*(55.7)19.3±4.11*(49.7)15.2±4.26*(52.5)頸復(fù)康顆粒揮發(fā)油成分低劑量組35 39.2±2.90＊△△(23.9)22.6±2.46*(46.7)19.6±3.84*(49.0)30.6±2.99＊△△(27.8)27.6±3.84＊△△(28.1)22.1±3.90＊△△(30.9)

表6 對(duì)小鼠熱板法致痛的影響(±s，n=10)

表6 對(duì)小鼠熱板法致痛的影響(±s，n=10)

注:表中()內(nèi)數(shù)字為痛閾提高百分率(%);與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01，＊＊＊P＜0.001;與頸復(fù)康顆粒組比較，△P＜0.05。

痛反應(yīng)潛伏期60 min空白對(duì)照組－14.92±2.97 15.26±2.96 14.73±2.72 14.83±2.組別給藥劑量/(g·kg－1)/s給藥前給藥后30 min給藥后40 min給藥后50 min給藥后61 15.02±2.39頸復(fù)康顆粒組12 15.20±3.26 20.94±3.05＊＊(37.2)20.44±3.54＊＊(36.1)頸復(fù)康顆粒揮發(fā)油成分高劑量組23.33±5.64＊＊＊(58.4)22.57±4.93＊＊＊(52.2)21.85±4.27＊＊＊(45.5)頸復(fù)康顆粒揮發(fā)油成分低劑量組70 15.04±3.25 19.91±3.56＊＊(30.5)22.63±4.90＊＊＊(53.6)22.77±4.26＊＊＊(53.5)35 14.91±3.62 17.78±3.28△(16.5)20.03±3.14＊＊(36.0)18.84±3.05＊＊(27.0)17.86±3.33*(18.9)

表7 對(duì)大鼠溫浴甩尾反應(yīng)的影響(x±s，n=8)

如表7所示，頸復(fù)康顆粒中揮發(fā)油成分高低兩個(gè)劑量組均可明顯延長(zhǎng)大鼠甩尾反應(yīng)時(shí)間，與空白對(duì)照組比較差異具有顯著性。

3 討論

抗炎實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，頸復(fù)康顆粒中揮發(fā)油成分對(duì)上述3種實(shí)驗(yàn)性炎癥模型具有非常顯著的抗炎作用。揮發(fā)油高低兩個(gè)劑量組對(duì)小鼠耳腫脹的抑制率分別為39.15%、29.58%。對(duì)大鼠足腫脹有非常顯著的抑制作用，藥物作用的達(dá)峰時(shí)間在2 h左右，但作用持續(xù)時(shí)間可達(dá)4 h以上，在致炎后4 h與對(duì)照組比較仍有非常顯著的差異。對(duì)醋酸所致小鼠腹腔毛細(xì)血管滲出的結(jié)果表明揮發(fā)油能夠明顯減少炎性滲出物的產(chǎn)生。

鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，頸復(fù)康顆粒中揮發(fā)油成分能夠非常明顯地提高化學(xué)刺激、溫?zé)岽碳に鹛弁吹耐撮撝怠]發(fā)油高低兩個(gè)劑量組對(duì)小鼠扭體反應(yīng)的抑制率分別為42.3%～52.5%、23.9%～30.9%。對(duì)小鼠熱板法痛閾提高百分率分別為30.5%～53.6%、16.5%～36.0%，顯示出較強(qiáng)的鎮(zhèn)痛效果。溫浴甩尾實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，揮發(fā)油具有起效快、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)的特點(diǎn)，藥后0.5 h即顯示出明顯的鎮(zhèn)痛作用，且能持續(xù)到3 h以上。

TNF-α、IL-1均為重要的炎癥介質(zhì)，低水平時(shí)主要在炎癥的局部起作用，對(duì)中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞有激活趨化作用。PGE2是活性較強(qiáng)的一種炎癥介質(zhì)和疼痛介質(zhì)，可擴(kuò)張小血管、增加微血管的通透性、吸引中性粒細(xì)胞，促進(jìn)炎癥反應(yīng)及組織損傷，并能增強(qiáng)組胺、5-羥色胺、緩激肽等其他炎癥、疼痛介質(zhì)的協(xié)同作用［11-12］。

頸復(fù)康顆粒中揮發(fā)油高低兩個(gè)劑量組均可顯著降低大鼠腫脹足中IL-1、TNF-α及PGE2水平，提示其抗炎鎮(zhèn)痛作用與降低IL-1、TNF-α及PGE2水平有關(guān)。

本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究初步證實(shí)了揮發(fā)油類成分具有明顯的抗炎鎮(zhèn)痛作用，且起效快、作用持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，是頸復(fù)康顆粒的主要有效部位之一，提示應(yīng)對(duì)頸復(fù)康顆粒中揮發(fā)油成分提取的生產(chǎn)工藝進(jìn)行深入研究，盡可能增加揮發(fā)油提取率和制劑固體化率，并開展頸復(fù)康顆粒中揮發(fā)油類指標(biāo)成分的含有量測(cè)定方法研究，制定相關(guān)成分含有量標(biāo)準(zhǔn)，提高產(chǎn)品的質(zhì)量可控性，從而進(jìn)一步保障產(chǎn)品質(zhì)量和臨床療效。

［1］楊麗娟.川芎的藥理研究進(jìn)展［J］.黑龍江醫(yī)藥，2010，23(4):599-600.

［2］李祖?zhèn)悾瑮罱鹑兀鷺s，等.川芎揮發(fā)油解熱作用及部分機(jī)理研究［J］.中醫(yī)藥信息，2003，20(6):31-32.

［3］劉國(guó)生，孫備，明亮.蒼術(shù)揮發(fā)油與水溶性成分的主要藥理作用比較［J］.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，38(2):124-126.

［4］黃羅生，顧燕飛，李紅.中藥揮發(fā)油及芳香性藥物的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)中藥雜志，2009，34(12):1605-1611.

［5］謝仁峰，文雙娥，李洋，等.柚皮苷抗炎鎮(zhèn)痛作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.湖南師范大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，8(4):5-8.

［6］陳奇.中藥藥理研究方法學(xué)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1993:305-307.

［7］鄧亞利，操紅纓，郭穎娟.獨(dú)行千里氯仿部位抗炎鎮(zhèn)痛作用及機(jī)制研究［J］.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，13(9):194-197.

［8］李儀奎，王欽茂.中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)［M］.上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社，2000:300-302.

［9］鄧琪，黃美景，郭麗冰，等.三丫苦抗炎鎮(zhèn)痛作用及機(jī)制研究［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17(4):125-128.

［10］徐淑云，卞如濂，陳修.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2002:885-887.

［11］Magder S，Neculcea J，Neculcea V，et al.Lipopolysaccharide and TNF-alpha produce very similar changes in gene expression in human endothelial cells［J］.J Vasc Res，2006，43(5):447-461.

［12］李玉林.病理學(xué)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2008:60-69.