HPLC 波長切換法同時測定丹參酚酸提取物中5種成分

暴鳳偉，劉玉強，胡麗萍，張振秋，侯學智，謝劍琳

(遼寧中醫藥大學，遼寧大連116600)

丹參為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhizaBge.的干燥根及根莖，始于《神農本草經》，列為上品，是我國常用的傳統中藥。味苦，性微寒;歸心、肝經;具有活血祛瘀，通經止痛，涼血消癰等功效;用于胸痹心痛，脘腹脅痛，癥瘕積聚，熱痹疼痛，心煩不眠，月經不調，痛經經閉，瘡瘍腫痛［1］。丹參有效成分分為脂溶性成分和水溶性成分兩大類［2］，脂溶性成分主要有丹參酮ⅡA、丹參酮ⅡB、丹參酮Ⅰ、隱丹參酮Ⅰ等;水溶性成分主要有丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B等。有關丹參酚酸提取物的報道［3-6］多為藥理作用和定量測定方法的研究，但同時測定丹參酚酸提取物中5種物質的報道較為少見。本實驗采用HPLC波長切換技術［7-8］建立了同時測定丹參酚酸提取物中丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B等5種成分的分析方法，該方法簡便、快速、準確，重復性好，為更好地控制丹參酚酸提取物的質量提供依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器Agilent-1100型高效液相色譜儀(儀器編號:20041191 DE43607375)，配置四元梯度泵、在線脫氣機、VWD檢測器;AS3120A超聲提取器(天津奧特賽恩斯儀器有限公司);2140型電子分析天平(上海奧豪斯公司)、METTLER AB135-S十萬分之一電子天平(瑞士);U-3010型紫外-可見分光光度計(日立公司)。

1.2 試藥對照品丹參素鈉(批號:110855-200809，純度為100%)，原兒茶醛(批號:110810-200205，純度為98.6%)，迷迭香酸(批號:111871-201001，純度為98.8%)和丹酚酸B(批號:111562-201009，純度為96.0%)均購于中國食品藥品檢定研究院。紫草酸(批號:110326，純度為98.8%)購于四川省維克奇生物科技有限公司。本研究收集了來自于上海、浙江、河北、云南、北京、山東、遼寧7個不同來源的丹參藥材，編號依次為1～7號，經遼寧中醫藥大學李峰教授鑒定均為正品藥材。乙腈、甲醇為色譜純(山東禹王化學試劑公司)，水為重蒸餾水，磷酸為分析純。

1.3 丹參酚酸提取物的制備取丹參藥材，加水回流提取3次，每次2 h，第一次加12倍量，第二次加10倍量，第三次加10倍量，濾過，合并濾液，并濃縮，通過AB-8大孔吸附樹脂柱，依次用水和50%的乙醇洗脫，收集50%乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮，干燥，即得。

2 方法與結果

2.1 色譜條件Phenomsil-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動相為乙腈(A)-0.5%磷酸溶液(B)，梯度洗脫(見表1);檢測波長為280 nm(0～50 min，丹參素鈉、原兒茶醛)，330 nm(50～68 min，迷迭香酸)，286 nm(68～90 min，紫草酸、丹酚酸B);體積流量1.0 mL/min;柱溫30℃;進樣量10 μL。

表1 流動相梯度洗脫程序Tab.1 Procedures of gradient elution

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液的制備分別精密稱取丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B等5個對照品，加甲醇制成每1 mL含丹參素鈉0.566 0 mg、原兒茶醛0.830 mg、迷迭香酸0.525 0 mg、紫草酸0.614 0 mg、丹酚酸B1.300 mg的對照品貯備液，備用。分別精密量取上述5個對照品貯備液適量，加甲醇制成每1 mL含丹參素鈉16.98 μg、原兒茶醛8.300 μg、迷迭香酸46.20 μg、紫草酸42.37 μg、丹酚酸B 650.0 μg的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備取不同來源的丹參酚酸提取物約50 mg，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，密塞，稱定質量，超聲處理(功率25W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定質量，用50%甲醇補足損失的質量，搖勻，濾過，即得。

2.3 系統適應性試驗按上述色譜條件，分別取混合對照品溶液和供試品溶液進樣10 μL，記錄色譜圖。結果表明混合對照品溶液色譜圖上，對照品色譜峰的理論塔板數均大于5 000，拖尾因子均在0.95～1.05之間;在供試品溶液的色譜圖上，與對照品相對應的色譜峰與其臨峰的分離度均大于1.5。混合對照品溶液及供試品溶液色譜圖見圖1。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系的考察分別精密量取上述混合對照品溶液2、4、8、12、16、20 μL注入高效液相色譜儀，測定。以進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程，結果見表2。

圖1 混合對照品溶液(A)和供試品溶液(5號)色譜圖(B)Fig.1 Chromatograms of a m ixture of reference substances(A)，sample(NO.5)(B)

表2 5種物質的標準曲線方程、相關系數和線性范圍Tab.2 Regression equations、correlation coefficients and linear ranges of five constituents

2.4.2 精密度試驗取丹參酚酸提取物(1號)約50 mg，精密稱定。按2.2.2項下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下連續進樣6次，測得丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B峰面積的RSD(n=6)分別為1.7%、1.2%、1.3%、1.5%、1.4%。結果表明，儀器精密度良好。

2.4.3 重復性試驗取丹參酚酸提取物(1號)約50 mg共6份，精密稱定。按2.2.2項下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進樣，測得丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B平均質量分數(n=6)分別為5.647、3.458、14.69、19.13、249.2 mg/g;RSD分別為1.5%、1.3%、1.5%、2.2%、1.2%。

2.4.4 穩定性試驗取同一供試品溶液(1號)，在室溫下放置，分別于0、2、4、8、12、24 h在上述色譜條件下進樣分析，測定峰面積。丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B峰面積的RSD(n=6)分別為1.7%、1.4%、1.6%、1.5%、1.4%。結果表明，供試品溶液中上述5種物質在24 h內穩定性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗稱取已知含有量(丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B的含有量分別為5.539、3.421、14.39、19.07、249.1 mg/g)的丹參酚酸提取物(上海)6份，每份約25 mg，精密稱定。分別準確加入丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B的對照品貯備液0.24、0.1、0.68、0.77、3.8 mL，按2.2.2項下方法制備供試溶液，在上述色譜條件下進行測定，計算回收率。結果上述丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B等5種物質的平均回收率(n=6)分別為99.1%、99.2%、100.1%、99.7%、100.2%;RSD分別為2.2%、2.3%、1.9%、1.7%、2.0%。結果見表3。

2.5 樣品測定取所收集的7個不同來源丹參藥材的丹參酚酸提取物約50 mg，精密稱定。按2.2.2項下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進樣測定，以外標法計算樣品中丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B等5種物質，結果見表4。并對丹參酚酸提取物進行綜合評分，設計丹參酚酸提取物中每種物質的含有量評分公式均為Y=(X－Xmin)/(Xmax－Xmin)×10(X為某物質的含有量，Y為計算分值)，5種物質權重系數均定為0.2，最終綜合評分結果公式為W=∑Y×0.2(W為綜合評分值)分，結果見表5。

3 討論

3.1 本實驗建立的方法對7個不同來源的丹參藥材的丹參酚酸提取物中5種成分進行了測定。結果表明7個來源的丹參酚酸提取物中丹參素鈉的質量分數2.778～8.874 mg/g，原兒茶醛的質量分數2.596～4.482 mg/g，迷迭香酸的質量分數14.40～41.69 mg/g，紫草酸的質量分數16.59～23.24 mg/g，丹酚酸B的質量分數193.3～382.5 mg/g。

3.2 中藥的藥效是多種物質共同作用的結果，以單一物質的含有量來評價其質量的優劣不能夠反映藥物發揮作用的整體性。本實驗同時測定丹參酚酸提取物中5種成分，采用綜合評分法科學地評價丹參酚酸提取物的質量。最終評分結果表明來自于遼寧的丹參酚酸提取物質量最佳。

表3 丹參酚酸提取物中5種物質加樣回收率試驗結果Tab.3 Recovery test results of five constituents in Salvia m iltiorrhiza phenolic acids extract

表4 丹參酚酸提取物中5種成分的測定結果(n=3)Tab.4 Analytical results of five constituents in Salvia m iltiorrhiza phenolic acids extract(n=3)

表5 不同產地丹參酚酸提取物綜合評分結果表Tab.5 Assessment results of different origins Salvia m iltiorrorrhiza phenolic acids extract

3.3 目前有關丹參的文獻報道［9-13］，沒有同時測定丹參酚酸提取物中丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B這5種成分。本實驗建立了HPLC波長切換法同時測定丹參酚酸提取物中5種成分，并取得了比較滿意的結果，該分析對丹參酚酸提取物的進一步研究、開發、利用和質量標準的制定提供了理論依據和科學參考。

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