HPLC法同時測定膽木及其制劑中酚酸和生物堿類成分

王靜靜，蔣俊，朱粉霞，李秀峰，賈曉斌*

(1.江蘇大學藥學院，江蘇鎮江212013;2.江蘇省中醫藥研究院國家中醫藥管理局中藥口服釋藥系統重點研究室，江蘇南京210028;3.鎮江出入境檢驗檢疫局，國家食品添加劑及調味劑檢測重點實驗室，江蘇鎮江212003;4.海南制藥廠有限公司黎藥工程中心，海南五指山572200)

膽木Nauclea officinalis為茜草科烏檀屬植物，是一味重要的黎族藥用植物，在我國海南一帶比較常用［1］。膽木注射液和膽木浸膏片均是由膽木單味藥材制得的中藥制劑，具有清熱解毒，消腫止痛之功效。臨床常用于治療上呼吸道感染、支氣管炎、急性扁桃體炎及咽喉炎等癥。

文獻報道［2-4］膽木中主要含有生物堿，五環三萜和有機酚酸等，認為這類物質是膽木發揮藥效的物質基礎。本研究室通過對膽木注射液化學成分的系統研究，發現膽木注射液中的有機小分子化合物主要由有機酚酸類和生物堿苷類組成，并采用液質聯用的方式鑒定了短小舌根草苷和異長春花苷內酰胺兩個生物堿成分［5］。進一步的研究表明膽木注射液中還含有原兒茶酸和3-表短小舌根草苷。液相色譜圖顯示上述4個成分的含有量均較高。這類化合物被證實具有一定的抗氧化、抗炎、抗微生物等活性［6-8］，很可能是膽木注射液發揮臨床療效的重要藥效成分。

本實驗中，作者選擇了原兒茶酸、短小舌根草苷、3-表短小舌根草苷和異長春花苷內酰胺4個成分作為含有量測定的指標，所建立的方法簡單、可靠，可作為控制膽木藥材及其制劑質量的一種方法。

1 儀器與試藥

Waters公司高效液相色譜儀(包括Waters在線脫氣機，600泵，717進樣器，2996紫外檢測器)，Empower數據處理系統;KQ5200型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，METTLER TOLEDO分析電子天平(瑞士METTLER TOLEDO公司，十萬分之一)。

乙腈(TEDIA公司，色譜純)，甲醇(南京化學試劑有限公司，分析純)，水為超純水;原兒茶酸(批號110809)購自中國藥品生物制品檢定所，短小舌根草苷，3-表短小舌根草苷，異長春花苷內酰胺對照品為實驗室自制(純度均高于98%)。

膽木藥材(批號:100303，110802)和膽木注射液(批號:110601，110801，110901，101101)均由海南制藥廠有限公司提供，藥材產于海南省五指山，經南京中醫藥大學吳德康教授鑒定為藥烏檀(N.officinalis)的帶皮心材。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液的制備分別精密稱取原兒茶酸、短小舌根草苷、3-表短小舌根草苷，異長春花苷內酰胺對照品5.0 mg置同一10 mL量瓶中，加入70%甲醇溶解至刻度，制得混合對照品貯備液。

2.2 供試品溶液的制備

2.2.1 膽木供試品溶液的制備取膽木心材(帶皮)適量，打成粗粉，精密稱取膽木藥材粗粉10 g，加入200 mL超純水，回流提取2 h，趁熱過濾，濾液冷卻至室溫，用超純水定容至200 mL，混勻，靜置，過0.45 μm微孔濾膜，取續濾液即得。

2.2.2 膽木注射液供試品溶液的制備取膽木注射液0.5 mL于10 mL量瓶中，以超純水定容，過0.45 μm微孔濾膜，濾液作為供試品溶液。

2.3 色譜條件X-SELECT CSHTMC18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5μm);流動相為乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)，梯度洗脫，0～10 min，6%～16%A，10～15 min，16%A，15～40 min，16%～41%A;檢測波長:258 nm(原兒茶酸)，243 nm(短小舌根草苷和3-表短小舌根草苷)和226 nm(異長春花苷內酰胺);體積流量1 mL/min;柱溫30℃;進樣量10μL。混合對照品，膽木藥材及膽木注射液樣品HPLC色譜圖見圖1。

2.4 線性關系精密吸取2.1項下對照品貯備液，采用逐步稀釋法分別制得原兒茶酸的質量濃度為0.966 0、19.32、38.64、77.28、154.56 μg/mL，短小舌根草苷的質量濃度為0.944 0、18.88、37.76、75.52、151.04 μg/mL，3-表短小舌根草苷的質量濃度為0.954 0、19.08、38.16、76.32、152.64 μg/mL，異長春花苷內酰胺的質量濃度為0.916 0、18.32、36.64、73.28、146.56 μg/mL的對照品溶液。按2.3項下色譜條件進行HPLC分析，以峰面積積分值(Y)對質量濃度(X)進行線性回歸，得到各成分的回歸方程、相關系數和線性范圍，見表1;將混合對照品不斷稀釋后分析，得到4個成分的最低檢測限(LOD:S/N≈3～4)和最低定量限(LOQ:S/N≈10～12)，見表1。

2.5 精密度試驗取混合對照品溶液，連續進樣6次，按2.3項下色譜條件測定各對照品峰面積，原兒茶酸，短小舌根草苷，3-表短小舌根草苷和異長春花苷內酰胺4種成分峰面積積分值的RSD分別為1.64%、0.42%、0.38%、0.80%，表明精密度良好。

圖1 對照品(A1～3)，膽木藥材(B1～3)和膽木注射液(C1～3)258、243和226nm下的HPLC圖Fig.1 Chromatogram s obtained by HPLC analysis of reference substances(A1-3)，N.officinalis(B1-3)and Danmu Injection(C1-3)at 258，243 and 226 nm

表1 4個待測成分的回歸方程、線性范圍、LOD、LOQ及相關系數Tab.1 Summary of calibration curves，linear ranges，LODs，LOQs and correlation coefficients for four compounds

2.6 重復性試驗取同一批號(100303)膽木藥材，按2.2.1項下操作方法制備膽木供試品溶液6份;取同一批號(101101)膽木注射液，按2.2.2項下操作方法制備供試品溶液6份。按2.3項下色譜條件測定，分別計算膽木藥材和膽木注射液中4種成分質量分數的RSD為1.74%，1.54%，1.30%，2.17%;1.53%，1.04%，2.32%，1.26%。表明本法重復性良好。

2.7 穩定性試驗取2.2項下處理好的同一份膽木供試品溶液和膽木注射液供試品溶液，室溫放置，分別在0、1、2、4、8、12、24 h進樣，按2.3項下色譜條件測定，以峰面積分別計算膽木藥材和膽木注射液中4種成分的RSD為1.12%，0.87%，1.02%，1.26%;1.50%，1.85%，1.18%，2.86%。表明穩定性良好。

2.8 加樣回收實驗

2.8.1 膽木藥材加樣回收實驗取同一批號膽木藥材粗粉6份，分別精密加入一定量(與樣品中含有量相當)的對照品。按2.2.1項下操作方法制備，按2.3項下色譜條件測定，分別計算回收率。4種成分的平均回收率分別為98.2%，101.3%，97.4%，99.2%;RSD分別為2.22%，2.06%，1.79%，3.62%。結果見表2，表明該方法準確度良好。

2.8.2 膽木注射液加樣回收實驗精密移取已知含有量的膽木注射液0.5 mL(批號:101101)，分別精密加入一定量(與注射液中含量相當的)對照品，稀釋至10 mL，按2.3項下色譜條件測定，分別計算回收率。4種成分的回收率分別為99.7%，103.0%，98.9%，100.7%;RSD分別為2.44%，1.09%，1.46%，2.16%。結果見表3，表明該方法準確度良好。

表2 膽木藥材加樣回收實驗結果Tab.2 Recoveries of four compounds in N.officinalis

表3 膽木注射液加樣回收實驗結果Tab.3 Recoveries of 4 compounds in Danmu injection

2.9 樣品測定分別取2個不同批號的膽木藥材及4個不同批號的膽木注射液按2.2項下方法操作，按上述色譜條件進樣分析，將測定值代入標準曲線，計算得含量結果，見表4。

表4 膽木藥材及其注射液中4種指標成分的量Tab.4 Contents of four compounds in N.officinalis and Danmu Injection

3 討論

研究表明，膽木及其制劑中含有的生物堿為吲哚類生物堿和喹啉酮類生物堿，這兩類生物堿結構中由于有p-π共軛效應的存在，往往堿性減弱，甚至呈現出中性或弱酸性，所以一方面采用常規的酸提堿沉法提取生物堿并不能達到理想的效果;另一方面，只有選擇酸性流動相才能使色譜峰減少拖尾，增加峰形的對稱性，較好地分離。本實驗分別考察了乙腈-0.05%甲酸、乙腈-0.05%乙酸、乙腈-0.05%磷酸3種不同流動相體系的色譜行為，發現甲酸和磷酸的分離效果最好，經綜合考慮本課題組選擇了甲酸作為流動相的添加劑。

膽木注射液為膽木的水煎煮提取液經一系列工藝精制得到的膽木提取物溶液，按照一定處方配比精制而得。本實驗選擇了水煎煮的提取方式，通過比較膽木藥材水煎煮提取液及膽木注射液中4種成分之間含有量的比例，可以發現，工藝過程中異長春花苷內酰胺所占比例明顯減少;在一定程度上反映了4種成分與膽木注射液工藝的相關性，為膽木注射液質量再評價提供一定的參考。另外，由結果可知，膽木藥材中原兒茶酸，3-表短小舌根草苷的含有量較低，在批號110802的藥材中測得極少，但在注射液中含量有所升高，異長春花苷內酰胺和短小舌根草苷是膽木及其注射液中的主要成分，是膽木注射液的重要藥效物質基礎。

目前對膽木藥材及其制劑的質量控制研究較少，文獻報道［7-11］多以單一成分異長春花苷內酰胺作為指標進行含有量測定。此外，張亞平［12］研究了以蘆丁為對照，采用紫外分光光度法測定膽木注射液中總黃酮的質控方法;而具有一定抗炎作用的酚酸類成分及其它種類生物堿的含有量測定尚未見報道，本課題組不久前報道了采用LC/MS鑒定膽木注射液中的短小舌根草苷和異長春花苷內酰胺，在后續的研究中本課題組從膽木注射液中還分離并鑒定出了原兒茶酸和短小舌根草苷的同分異構體3-表短小舌根草苷。本實驗可為全面控制膽木注射液質量提供新的分析手段，并為進一步研究膽木注射液的藥理藥效提供實驗依據，為膽木注射液的再評價研究提供參考。

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