松材線(xiàn)蟲(chóng)病病原學(xué)研究的幾個(gè)問(wèn)題

葉建仁，黃麟

(南京林業(yè)大學(xué)森林資源與環(huán)境學(xué)院，江蘇省有害生物預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210037)

松材線(xiàn)蟲(chóng)病又稱(chēng)松樹(shù)萎蔫病，可在短時(shí)間內(nèi)導(dǎo)致松樹(shù)死亡，是松樹(shù)上的一種毀滅性病害。該病寄主包括黑松、赤松和馬尾松等數(shù)十種松屬植物，也危害少數(shù)非松屬針葉樹(shù)［1］。日本1905年首次報(bào)道了該病在長(zhǎng)崎縣引起松樹(shù)大面積枯死。目前該病分布于美國(guó)、加拿大、墨西哥、葡萄牙、韓國(guó)、日本及中國(guó)等多個(gè)國(guó)家，其中在日本、中國(guó)和韓國(guó)發(fā)生最為嚴(yán)重［2-3］。我國(guó)自1982年在南京中山陵首次發(fā)現(xiàn)該病短短30年時(shí)間里，疫情已擴(kuò)大到江蘇、安徽、廣東、浙江、山東、福建、江西、廣西、四川等16個(gè)省區(qū)，每年發(fā)生面積近10萬(wàn)hm2，累計(jì)致死松樹(shù)5 000多萬(wàn)株，直接經(jīng)濟(jì)損失25億元，間接損失250億元。近年來(lái)疫情擴(kuò)散蔓延呈加劇之勢(shì)，已逼近黃山等著名風(fēng)景名勝區(qū)、世界自然文化遺產(chǎn)地和重點(diǎn)生態(tài)區(qū)域，對(duì)我國(guó)大面積松林構(gòu)成嚴(yán)重威脅，是我國(guó)最具危險(xiǎn)性的頭號(hào)森林病害［4］。該病涉及到寄主松樹(shù)、線(xiàn)蟲(chóng)、天牛、真菌、細(xì)菌以及環(huán)境因素等多個(gè)方面［5-6］，至今其致病機(jī)理尚未完全弄清，對(duì)其治理也較為被動(dòng)，還沒(méi)有特別有效的防治措施。病原學(xué)的深入研究是揭示松材線(xiàn)蟲(chóng)病致病機(jī)制和流行規(guī)律的前提，也是科學(xué)有效實(shí)施防治的基礎(chǔ)。關(guān)于該病的病原、致病分子機(jī)理等基礎(chǔ)性問(wèn)題的研究有助于突破松材線(xiàn)蟲(chóng)病研究中長(zhǎng)期未能解決的關(guān)鍵問(wèn)題，為該病的科學(xué)防控提供理論基礎(chǔ)。

1 松材線(xiàn)蟲(chóng)病的病原

關(guān)于松材線(xiàn)蟲(chóng)病的病原，長(zhǎng)期以來(lái)松材線(xiàn)蟲(chóng)被認(rèn)為是該病的惟一病原，接種實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)松材線(xiàn)蟲(chóng)能引起松樹(shù)萎蔫［7-9］。在接種的早期階段即樹(shù)脂分泌停止階段，松樹(shù)體內(nèi)線(xiàn)蟲(chóng)量較少;當(dāng)松樹(shù)針葉變黃時(shí)樹(shù)體內(nèi)線(xiàn)蟲(chóng)的蟲(chóng)口數(shù)快速增長(zhǎng)，病情逐漸惡化;松樹(shù)死后線(xiàn)蟲(chóng)數(shù)量又逐漸減少［10］。將松材線(xiàn)蟲(chóng)經(jīng)制霉菌素、青霉素消毒后得到無(wú)菌線(xiàn)蟲(chóng)，接種實(shí)驗(yàn)證實(shí)無(wú)菌線(xiàn)蟲(chóng)的致病性并未喪失［11］。研究還發(fā)現(xiàn)接種黑松1周后黑松的水分輸導(dǎo)即受阻，但松樹(shù)體內(nèi)的微生物相和健康松樹(shù)相似，直至接種5周后，藍(lán)變菌開(kāi)始出現(xiàn)，細(xì)菌才開(kāi)始增多，因此認(rèn)為接種松材線(xiàn)蟲(chóng)的致病性與其它微生物無(wú)關(guān)［12］。最新的研究發(fā)現(xiàn)從卵階段就開(kāi)始無(wú)菌化處理獲得的無(wú)菌線(xiàn)蟲(chóng)，在無(wú)菌條件下對(duì)無(wú)菌組培苗的致病性測(cè)定表明，無(wú)菌松材線(xiàn)蟲(chóng)及帶菌松材線(xiàn)蟲(chóng)接種均能使赤松和濕地松無(wú)菌苗發(fā)生萎蔫，無(wú)菌化處理并未使松材線(xiàn)蟲(chóng)喪失致病性，而松材線(xiàn)蟲(chóng)體表細(xì)菌單獨(dú)接種未能使無(wú)菌苗發(fā)病。無(wú)菌松材線(xiàn)蟲(chóng)在發(fā)病植株體內(nèi)大量繁殖，病株體內(nèi)的線(xiàn)蟲(chóng)回收后依然保持無(wú)菌狀態(tài)［13］，這些工作表明松材線(xiàn)蟲(chóng)可以單獨(dú)引起松樹(shù)萎蔫，松材線(xiàn)蟲(chóng)是導(dǎo)致松樹(shù)發(fā)病的直接原因。

早期的研究發(fā)現(xiàn)感染松材線(xiàn)蟲(chóng)病的病木生理和組織病理學(xué)變化往往在線(xiàn)蟲(chóng)數(shù)量快速增長(zhǎng)之前出現(xiàn)，因此推測(cè)可能其他因素參與了該病的病理學(xué)過(guò)程，并認(rèn)為松材線(xiàn)蟲(chóng)攜帶的產(chǎn)毒素細(xì)菌 Pseudomonas spp.可能在松材線(xiàn)蟲(chóng)病中發(fā)揮作用［14-15］。后來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，松材線(xiàn)蟲(chóng)攜帶包括細(xì)菌和真菌在內(nèi)的大量伴生微生物類(lèi)群［16-18］。有研究認(rèn)為松材線(xiàn)蟲(chóng)攜帶的伴生細(xì)菌在該病的病程中發(fā)揮重要作用，該病是由松材線(xiàn)蟲(chóng)和伴生細(xì)菌共同引起的復(fù)合侵染病害。該觀點(diǎn)認(rèn)為松材線(xiàn)蟲(chóng)病是松材線(xiàn)蟲(chóng)與其體表攜帶的致病細(xì)菌共同侵入寄主，致病細(xì)菌分泌毒素導(dǎo)致寄主萎蔫和死亡。松材線(xiàn)蟲(chóng)攜帶細(xì)菌侵入樹(shù)體后，線(xiàn)蟲(chóng)在為致病細(xì)菌提供營(yíng)養(yǎng)和保護(hù)作用，而致病細(xì)菌在產(chǎn)毒和促進(jìn)線(xiàn)蟲(chóng)繁殖等方面起重要作用，二者對(duì)誘發(fā)寄主的萎蔫和死亡缺一不可。松材線(xiàn)蟲(chóng)的無(wú)菌化處理會(huì)導(dǎo)致其致病性減弱，甚至完全喪失其致病性［19-26］。

但是目前松材線(xiàn)蟲(chóng)攜帶細(xì)菌致病的觀點(diǎn)存在較大爭(zhēng)議。如很難對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)的致病性分化，特別是對(duì)同一地區(qū)的松材線(xiàn)蟲(chóng)的致病性分化做出合理的解釋?zhuān)谧匀粭l件下存在部分松材線(xiàn)蟲(chóng)蟲(chóng)株完全喪失了致病力的現(xiàn)象，其中蟲(chóng)株C14-5就是被廣泛使用的松材線(xiàn)蟲(chóng)的無(wú)毒突變株［27-32］。另外，松材線(xiàn)蟲(chóng)蟲(chóng)株間攜帶細(xì)菌種類(lèi)和數(shù)量差異較大［33-36］。不同地區(qū)、不同寄主體上致病力相同的蟲(chóng)株，它們所攜帶的細(xì)菌種類(lèi)和數(shù)量可能是不同的，或致病力不同的蟲(chóng)株可能帶有相似的細(xì)菌菌株。目前的研究沒(méi)能從具有致病力不同的線(xiàn)蟲(chóng)蟲(chóng)株體表獲得有相同的或共同的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌種類(lèi)，因此很難做出其與致病性相聯(lián)系的合理解釋。此外，該觀點(diǎn)也無(wú)法很好的評(píng)價(jià)松材線(xiàn)蟲(chóng)作為一種植物線(xiàn)蟲(chóng)在松樹(shù)體內(nèi)的取食、移動(dòng)、繁殖以及松材線(xiàn)蟲(chóng)及其代謝產(chǎn)物與寄主植物互作過(guò)程中可能引起的植物細(xì)胞的破壞及病變反應(yīng)在病程發(fā)展中的作用。植物線(xiàn)蟲(chóng)對(duì)植物的致病作用已經(jīng)有大量的實(shí)驗(yàn)證實(shí)［37-38］。因此，關(guān)于松材線(xiàn)蟲(chóng)攜帶的細(xì)菌在松材線(xiàn)蟲(chóng)病的致病過(guò)程中的作用，哪些細(xì)菌在松材線(xiàn)蟲(chóng)的體表是普遍存在的，這些細(xì)菌是如何影響或發(fā)揮致病作用的，都還需要大量的研究給予進(jìn)一步的證實(shí)。目前國(guó)內(nèi)外大量的有關(guān)松材線(xiàn)蟲(chóng)病的致病性形成機(jī)制的研究工作主要還是將松材線(xiàn)蟲(chóng)作為松材線(xiàn)蟲(chóng)病的病原來(lái)展開(kāi)的［39］。

2 松材線(xiàn)蟲(chóng)致病性相關(guān)基因的研究

2.1 食道腺在松材線(xiàn)蟲(chóng)致病中的作用 線(xiàn)蟲(chóng)在侵染寄生過(guò)程中，用口針刺入植物組織中，食道腺分泌物通過(guò)口針注入植物細(xì)胞，這些分泌物可以改變細(xì)胞質(zhì)以利于取食。與其他植物線(xiàn)蟲(chóng)一樣，松材線(xiàn)蟲(chóng)的食道腺位于其身體的前端，包括1個(gè)背食道腺和2個(gè)亞腹食道腺細(xì)胞［40］。線(xiàn)蟲(chóng)食道腺分泌物含有高濃度的蛋白，在不同的寄生階段和不同的食道腺中蛋白的種類(lèi)和數(shù)量均有差別［41-42］。食道腺分泌的蛋白可能在植物線(xiàn)蟲(chóng)不同的寄生階段具有不同的作用，在線(xiàn)蟲(chóng)侵染寄主植物的早期亞腹食道腺分泌的蛋白起主要作用，而在線(xiàn)蟲(chóng)寄生后期亞腹食道腺開(kāi)始萎縮，背食道腺活性明顯增加［43-44］。分泌物對(duì)植物細(xì)胞及其內(nèi)含物的修飾作用，有利于植物線(xiàn)蟲(chóng)的取食與移動(dòng)［41］。因此，基因表達(dá)位點(diǎn)分析可以作為植物線(xiàn)蟲(chóng)致病基因功能分析的重要參考，如某些植物線(xiàn)蟲(chóng)致病基因的作用位點(diǎn)在食道腺細(xì)胞，那么它們可能就與植物線(xiàn)蟲(chóng)的取食、寄生和對(duì)寄主植物的致病性密切相關(guān)。目前，分析基因的表達(dá)位點(diǎn)可以通過(guò)對(duì)mRNA的原位雜交［45］以及針對(duì)蛋白的原位免疫熒光分析［46］確定。在對(duì)南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的研究中，采用微吸法獲得食道腺細(xì)胞內(nèi)含物并構(gòu)建了食道腺特異表達(dá)的cDNA文庫(kù)，獲得包括185個(gè)含有信號(hào)肽序列的線(xiàn)蟲(chóng)分泌蛋白cDNA的2 452個(gè)克隆，經(jīng)高通量的原位雜交的方法鑒定了37個(gè)含有信號(hào)肽序列，其中13個(gè)基因在亞腹食道腺表達(dá)，24個(gè)在背食道腺表達(dá)，并推測(cè)這些基因可能在南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)致病過(guò)程中發(fā)揮重要作用［47］。

2.2 松材線(xiàn)蟲(chóng)的致病相關(guān)基因克隆 植物線(xiàn)蟲(chóng)在侵染植物過(guò)程中需要抵御寄主植物的防衛(wèi)反應(yīng)，通過(guò)在寄主體內(nèi)取食和移動(dòng)等來(lái)維持正常的生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，越來(lái)越多的涉及線(xiàn)蟲(chóng)在寄生過(guò)程中與致病相關(guān)的基因被克隆，這些基因的功能研究有助于對(duì)植物線(xiàn)蟲(chóng)的寄生、致病機(jī)理做出科學(xué)的推測(cè)及闡釋。

2.2.1 內(nèi) 切 β-1，4-葡 聚 糖 酶 (β-1，4-endoglucanase) 植物細(xì)胞壁是植物抵御病原菌的物理屏障，病原物通過(guò)分泌細(xì)胞壁降解酶分解寄主植物細(xì)胞壁，侵入寄主植物組織，并從其酶解過(guò)程中獲得生長(zhǎng)發(fā)育、繁殖及定殖于寄主植物必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。植物細(xì)胞壁主要成分是纖維素，一些植物病原細(xì)菌和病原真菌，通過(guò)自身分泌的纖維素酶破壞植物組織細(xì)胞壁纖維素來(lái)侵染寄主植物［48-49］。植物線(xiàn)蟲(chóng)的研究表明植物線(xiàn)蟲(chóng)分泌物中也含有大量的纖維素酶蛋白，該類(lèi)蛋白參與了植物線(xiàn)蟲(chóng)對(duì)植物細(xì)胞壁的修飾作用，是一類(lèi)植物線(xiàn)蟲(chóng)重要的致病因子［50-52］。

纖維素酶包含有14個(gè)糖基水解酶家族，其中有5 個(gè)(GHF5，6，9，10，45)在動(dòng)物研究中有報(bào)道，它們?cè)谙到y(tǒng)進(jìn)化上有明顯差異。利用松材線(xiàn)蟲(chóng)蟲(chóng)卵與蟲(chóng)體的抑制消減雜交與RACE技術(shù)相結(jié)合的方法從松材線(xiàn)蟲(chóng)中克隆的內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶基因ENGL1，全長(zhǎng)cDNA為797 bp，包含1個(gè)675 bp的開(kāi)放閱讀框，5′非翻譯區(qū)長(zhǎng)24 bp，不含有線(xiàn)蟲(chóng)剪接引導(dǎo)序列SL1，3′非翻譯區(qū)長(zhǎng)97 bp，含有加尾信號(hào)序列TATAAA。ENGL1含有1個(gè) N-糖基化位點(diǎn)(84 NLSY)、5個(gè)蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)、5個(gè)酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)、6個(gè)N端酰基化位點(diǎn)、1個(gè)酰胺化位點(diǎn)和1個(gè)Prokaryotic membrane lipoproteinlipid attachment site和1個(gè)糖基水解酶GHF45家族活性位點(diǎn)(21 TTRYWDCCKPSC)。ENGL1含有2個(gè)低復(fù)雜度區(qū)域，分別為 4Lys-15Ala，58Gly-70Ser(53)。ENGL1與數(shù)據(jù)庫(kù)中松材線(xiàn)蟲(chóng)內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶蛋白 ACD12136，BAD34546，ACN42745的相似性分別為99%，91%，75%。與ACD12136的相似性最高，二者的氨基酸序列僅有3個(gè)殘基差異，分別出現(xiàn)在ENGL1信號(hào)肽序列的6L的缺失和11D殘基取代了G，以及216E殘基取代了K殘基。

目前在松材線(xiàn)蟲(chóng)上發(fā)現(xiàn)GHF45家族蛋白內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶基因的催化活性位點(diǎn)與真菌短帚霉和米根霉的GHF45家族高度相似，而在自由生活線(xiàn)蟲(chóng)秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)和Caenorhabditis briggsae的全基因組中并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)GHF45家族基因，因此認(rèn)為該類(lèi)基因可能通過(guò)水平基因轉(zhuǎn)移的方式從真菌中獲得。真核表達(dá)產(chǎn)物分析表明，松材線(xiàn)蟲(chóng)的Bx-eng-1是以非糖基化的單體形式存在，而B(niǎo)x-eng-2和Bx-eng-3是以糖基化的二聚體形式存在，體外表達(dá)產(chǎn)物的酶學(xué)性質(zhì)分析表明三者具有相似的酶學(xué)特性，其最適的pH為6.0，最佳活性溫度為60℃［53-54］。RNAi研究表明，dsRNA浸泡24 h能顯著導(dǎo)致該基因的轉(zhuǎn)錄后基因沉默效應(yīng)，降低其纖維素酶活性，同時(shí)浸泡處理能顯著減少F1的線(xiàn)蟲(chóng)個(gè)體數(shù)量，因此認(rèn)為該基因可能在松材線(xiàn)蟲(chóng)的致病性和線(xiàn)蟲(chóng)的取食、發(fā)育和繁殖中發(fā)揮作用［55］。

2.2.2 內(nèi) 切 β-1，3-葡 聚 糖 酶 (β-1，3-endoglucanase) β-1，3-葡聚糖酶催化水解 β-1，3-D-葡聚糖糖苷鍵，內(nèi)切 β-1，3-葡聚糖酶和外切 β-1，3-葡聚糖酶兩大類(lèi)。該類(lèi)酶廣泛分布于細(xì)菌、真菌和高等植物。細(xì)菌β-1，3-葡聚糖酶的功能主要是真菌細(xì)胞壁的降解從而有利于細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)攝取;真菌中該酶參與真菌的細(xì)胞發(fā)育與分化，并在植物病原真菌與寄主的互作中發(fā)揮重要功能;植物中的參與了植物細(xì)胞分化和對(duì)病原真菌的防御反應(yīng)［56-58］。在海洋無(wú)脊椎動(dòng)物和線(xiàn)蟲(chóng)中均有β-1，3-葡聚糖酶基因克隆的報(bào)道［59-60］。

Kikuchi等［61］分別從松材線(xiàn)蟲(chóng)和擬松材線(xiàn)蟲(chóng)中克隆了1個(gè)內(nèi)切β-1，3-葡聚糖酶基因 Bx-lam16A，推導(dǎo)氨基酸序列含有明顯的信號(hào)肽特征序列和GHF16家族保守序列殘基，BxLAM16A與來(lái)自Xanthomonascampestris，X．Axonopodis，Pseudomonas sp.的β-1，3-葡聚糖酶的相似性達(dá)到了49%～43%。BxLAM16A體外表達(dá)產(chǎn)物酶活性分析發(fā)現(xiàn)，該酶對(duì)可溶性的β-1，3-葡聚糖昆布多糖的水解活性最高，β-1，3-1，4-交聯(lián)葡聚糖表現(xiàn)出較低活性，β-1，4-交聯(lián)葡聚糖底物無(wú)催化水解活性。該酶活最適pH為4.9，最適溫度為65℃，該蛋白的表達(dá)位點(diǎn)為食道腺細(xì)胞，推測(cè)該基因可能參與了松材線(xiàn)蟲(chóng)對(duì)植物細(xì)胞壁的修飾作用。序列同源性分析表明細(xì)菌β-1，3-葡聚糖酶屬于GHF16家族，而大多數(shù)植物和真菌源的β-1，3-葡聚糖酶則屬于GHF17家族。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)BxLAM16A與來(lái)自細(xì)菌的GHF16家族高度同源，而與來(lái)自其他動(dòng)物的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系較遠(yuǎn)，認(rèn)為該基因很可能是通過(guò)水平基因轉(zhuǎn)移的方式從原核生物中獲得的。

2.2.3 果膠質(zhì)酶 植物細(xì)胞果膠質(zhì)沉積于初生細(xì)胞壁和細(xì)胞間層，在初生壁中與不同含量的纖維素、半纖維素、木質(zhì)素的微纖絲以及某些伸展蛋白相互交聯(lián)，使得細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)堅(jiān)硬，表現(xiàn)出固體的形態(tài)，同時(shí)構(gòu)成抵御病原微生物入侵的天然屏障［62］。果膠酶通過(guò)β-消去反應(yīng)催化降解α-1，4-果膠酸鹽，該反應(yīng)在果膠質(zhì)的降解過(guò)程中發(fā)揮了重要作用［63］。果膠酶廣泛存在于植物病原細(xì)菌、真菌和線(xiàn)蟲(chóng)中，主要作用是降解植物細(xì)胞壁從而有利于病原物的侵入和定殖［63］。在植物線(xiàn)蟲(chóng)中，果膠質(zhì)酶在食道腺細(xì)胞產(chǎn)生，通過(guò)口針?lè)置谶M(jìn)入植物細(xì)胞，在侵染和致病性等方面發(fā)揮重要作用。在部分孢囊線(xiàn)蟲(chóng)和根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)中均有果膠質(zhì)酶基因克隆的報(bào)道［64-66］。

目前從松材線(xiàn)蟲(chóng)中成功克隆了2個(gè)果膠酶基因Bx-pel-1和Bx-pel-2，推測(cè)的氨基酸序列BxPEL1和BxPEL2的N端含有明顯的信號(hào)肽特征序列，與多糖降解酶家族3PL3有著較高的相似性，BxPEL1和BxPEL2的氨基酸序列相似性為64%。原位雜交分析發(fā)現(xiàn)Bx-pel-1在植物線(xiàn)蟲(chóng)的食道腺部位特異表達(dá)。體外重組蛋白活性分析表明，BxPEL1對(duì)聚半乳糖醛酸具有明顯的催化降解活性，而對(duì)甲基化果膠質(zhì)具有較低的催化降解活性，研究還發(fā)現(xiàn)Bx-PEL1為Ca2+依賴(lài)蛋白，其最適溫度是55℃，最適pH 是 8 ～10［67］。

2.2.4 過(guò)氧化物酶(Peroxidase) 活性氧的產(chǎn)生在植物的免疫防衛(wèi)反應(yīng)和對(duì)病原物的識(shí)別中發(fā)揮著重要作用，其參與了信號(hào)傳導(dǎo)、抑菌作用、membrane lipoxidation、細(xì)胞壁修飾、誘導(dǎo)抗性和細(xì)胞過(guò)敏性壞死［68-69］。而病原物則通過(guò)產(chǎn)生抗氧化劑來(lái)有效抵御寄主的活性氧防衛(wèi)反應(yīng)［70］。因此，能否清除寄主植物產(chǎn)生的活性氧就成為病原物能否在寄主植物體內(nèi)成功定殖的關(guān)鍵。在真核生物中，主要的抗氧化劑包括對(duì)超氧根陰離子具有解毒作用的超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(Glutathione peroxidase，GPX)和 Peroxiredoxin(Prx)等。有研究發(fā)現(xiàn)植物線(xiàn)蟲(chóng)的真皮層能夠分泌一種硫氧化蛋白過(guò)氧化物酶，該蛋白具有特異代謝過(guò)氧化氫的活性，推測(cè)該蛋白可能與線(xiàn)蟲(chóng)抵御植物防衛(wèi)反應(yīng)有關(guān)［71］。谷胱甘肽過(guò)氧化物酶是生物消除過(guò)氧化氫抵御氧脅迫的主要方式。Prx蛋白屬于抗氧化蛋白超家族，在原核生物、植物、無(wú)脊椎動(dòng)物和哺乳動(dòng)物中廣泛存在［72］。大量的研究表明，Prx蛋白在病原物與寄主植物的互作中發(fā)揮重要作用，是許多病原物防治的重要靶標(biāo)［73］。Prx作為抗氧化還原酶對(duì)過(guò)氧化氫的分解需要有氧化還原活性半胱氨酸的參與。根據(jù)其保守Cys的數(shù)目不同，可以分為2個(gè)亞家族，即1-Cys Prx和2-Cys Prx。Prx與過(guò)氧化氫酶和GPX不同，其催化活性不需要金屬離子或者輔基等氧化還原因子的參與［74］。

在松材線(xiàn)蟲(chóng)中有1個(gè)Prx基因BxPrx已經(jīng)被克隆，BxPrx含有2個(gè)保守的半胱氨酸位點(diǎn)Cp和Cr，1個(gè)threonine-cysteine-arginine催化三元體，2個(gè)對(duì)過(guò)氧化氫敏感的標(biāo)簽元件GGLG和YF。保守結(jié)構(gòu)域分析和三維結(jié)構(gòu)模擬的結(jié)果都表明BxPrx具有氧化還原功能。BxPrx盡管沒(méi)有信號(hào)肽結(jié)構(gòu)，但其結(jié)構(gòu)中還有23個(gè)連續(xù)的疏水氨基酸形成α-螺旋的跨膜結(jié)構(gòu)，BxPrx在不含有信號(hào)肽的條件下，可能依賴(lài)于這一跨膜結(jié)構(gòu)或ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子實(shí)現(xiàn)其跨膜運(yùn)輸。體外表達(dá)產(chǎn)物的酶活分析表明BxPrx在以谷胱甘肽作為電子供體的情況下表現(xiàn)出了對(duì)過(guò)氧化氫的還原活性［75］。

2.2.5 擴(kuò)展蛋白(Expansin) 擴(kuò)展蛋白是植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中具有調(diào)節(jié)功能的重要蛋白，該蛋白通過(guò)在植物細(xì)胞壁中的纖維素纖絲和基質(zhì)多糖交叉處，以一種可逆的方式作用于微纖絲表面的基質(zhì)聚合物，使多聚網(wǎng)絡(luò)間的非共價(jià)鍵斷裂，促進(jìn)聚合物滑動(dòng)，在植物細(xì)胞壁的生長(zhǎng)和分解等方面發(fā)揮重要作用，該類(lèi)蛋白在植物線(xiàn)蟲(chóng)中普遍存在［76-78］。Kikuchi等［79］從松材線(xiàn)蟲(chóng)和擬松材線(xiàn)蟲(chóng)中分離獲得的擴(kuò)展蛋白在食道腺細(xì)胞的特異表達(dá)，與來(lái)自馬鈴薯金線(xiàn)蟲(chóng)等植物線(xiàn)蟲(chóng)的擴(kuò)展含有碳水化合物結(jié)合位點(diǎn)不同，在松材線(xiàn)蟲(chóng)和擬松材線(xiàn)蟲(chóng)的擴(kuò)展蛋白中不含有類(lèi)似的結(jié)合位點(diǎn)，推測(cè)該基因參與了寄主植物與植物線(xiàn)蟲(chóng)的互作，最有可能在協(xié)助線(xiàn)蟲(chóng)在植物體內(nèi)的移動(dòng)方面發(fā)揮重要作用。

2.2.6 毒液過(guò)敏蛋白(Venom allergen-like protein)

毒液過(guò)敏蛋白作為SCP蛋白家族成員，在真核生物中普遍存在，在其結(jié)構(gòu)中含有SCP/TAPS保守結(jié)構(gòu)域，許多含有這一結(jié)構(gòu)域的蛋白為胞外泌出蛋白［80-81］。研究發(fā)現(xiàn)該類(lèi)基因在大豆孢囊線(xiàn)蟲(chóng)和南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)等植物線(xiàn)蟲(chóng)的寄生階段高量表達(dá)，但其功能尚不清楚［82-84］。

從松材線(xiàn)蟲(chóng)中克隆了3個(gè)類(lèi)毒液過(guò)敏蛋白Bxvap-1，Bx-vap-2，Bx-vap-3，表達(dá)位點(diǎn)都位于松材線(xiàn)蟲(chóng)的食道腺細(xì)胞。結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)3個(gè)基因都含有信號(hào)肽特征序列及SCP/TAPS保守序列，表達(dá)量分析發(fā)現(xiàn)Bx-vap-1在松樹(shù)體內(nèi)的繁殖型階段的蟲(chóng)體上表達(dá)量最高，dsRNA介導(dǎo)的Bx-vap-1基因沉默顯著降低了松材線(xiàn)蟲(chóng)在松樹(shù)體內(nèi)的遷移速率［85］。因此，該基因的功能可能協(xié)助線(xiàn)蟲(chóng)在樹(shù)體內(nèi)的遷移，參與了植物線(xiàn)蟲(chóng)抑制寄主植物的防衛(wèi)反應(yīng)。

3 松材線(xiàn)蟲(chóng)病流行的病原學(xué)研究

收集我國(guó)1982-2005年間松材線(xiàn)蟲(chóng)病疫情普查數(shù)據(jù)、專(zhuān)項(xiàng)調(diào)查報(bào)告、疫情分析報(bào)告、國(guó)家報(bào)告等資料，應(yīng)用地統(tǒng)計(jì)學(xué)和克里格插值方法分析松材線(xiàn)蟲(chóng)病在我國(guó)的空間分布結(jié)構(gòu)和空間相關(guān)性。在全國(guó)和江蘇、安徽、廣東、浙江5個(gè)不同空間尺度下，松材線(xiàn)蟲(chóng)病發(fā)生疫點(diǎn)的空間半變異函數(shù)均為球形，在空間格局上呈聚集分布。松材線(xiàn)蟲(chóng)病在中國(guó)有著2個(gè)明顯的聚集分布區(qū)域，一個(gè)位于30.5～32.5 N，117.7～120.5 E，以南京為中心，包括江蘇、安徽大部和浙江西北部;另一個(gè)位于22.5～24 N，113～114.5 E，在廣東境內(nèi)［86］。

對(duì)收集自我國(guó)13個(gè)省、49個(gè)縣(市、區(qū))的173個(gè)松材線(xiàn)蟲(chóng)蟲(chóng)株以及南京林業(yè)大學(xué)江蘇省有害生物預(yù)防與控制實(shí)驗(yàn)室保存的部分來(lái)自美國(guó)、日本的松材線(xiàn)蟲(chóng)蟲(chóng)株和擬松材線(xiàn)蟲(chóng)蟲(chóng)株的RAPD分析及遺傳多樣性分析表明，松材線(xiàn)蟲(chóng)與擬松材線(xiàn)蟲(chóng)種間與種內(nèi)都存在著較高的遺傳多樣性，且二者種間的遺傳變異大于種內(nèi)。中國(guó)松材線(xiàn)蟲(chóng)群體間的遺傳相似性較高，平均在0.9以上，與日本的平均遺傳距離是0.274 2，與美國(guó)的是0.424 2，中國(guó)群體與日本群體的親緣關(guān)系比與美國(guó)更為接近。山東長(zhǎng)島群體與日本群體的遺傳距離僅為0.15［87］。

松材線(xiàn)蟲(chóng)的遺傳多樣性分析同樣證實(shí)我國(guó)存在以廣東和江蘇為中心的2個(gè)聚集分布區(qū)，但2個(gè)聚集分布區(qū)形成原因迥異，蘇皖聚集分布區(qū)域的形成是松材線(xiàn)蟲(chóng)病傳入南京后依靠自然或人為因素不斷圍繞始發(fā)區(qū)域向外擴(kuò)散的內(nèi)源性擴(kuò)散所致，區(qū)域內(nèi)各疫點(diǎn)松材線(xiàn)蟲(chóng)具有較高的同源性，很可能來(lái)自同一個(gè)疫源。廣東聚集分布區(qū)各域疫點(diǎn)間松材線(xiàn)蟲(chóng)的遺傳特性具有一定的異質(zhì)性，其形成主要體現(xiàn)為外源性，是由于區(qū)域外松材線(xiàn)蟲(chóng)的不斷入侵所致［87］。

根據(jù)各線(xiàn)蟲(chóng)蟲(chóng)株的遺傳相似性模擬的松材線(xiàn)蟲(chóng)在我國(guó)可能的傳播路徑發(fā)現(xiàn)，安徽松材線(xiàn)蟲(chóng)疫源最初很可能來(lái)自江蘇，此后在全省范圍內(nèi)流行。廣東松材線(xiàn)蟲(chóng)病可能存在不同的源頭，東莞市和韶關(guān)市乳源縣疫情最有可能來(lái)自浙江寧波的象山市，惠州市惠城區(qū)和廣州增城市的松材線(xiàn)蟲(chóng)可能分別源自不同的國(guó)外地區(qū)。象山市疫點(diǎn)疫源最有可能來(lái)自安徽，杭州富陽(yáng)市可能有2個(gè)分別來(lái)自國(guó)外的疫源。江西贛州市章貢區(qū)疫情最有可能來(lái)源于安徽馬鞍山。湖南益陽(yáng)市松材線(xiàn)蟲(chóng)可能分別來(lái)源于國(guó)外、浙江和貴州等3個(gè)不同區(qū)域。廣西桂林和防城港兩地疫情均可能來(lái)自象山市。湖北恩施市松材線(xiàn)蟲(chóng)最有可能由安徽馬鞍山、明光等地傳入。貴州遵義縣松材線(xiàn)蟲(chóng)可能來(lái)源于浙江舟山市普陀區(qū)。四川鄰水縣松材線(xiàn)蟲(chóng)與全國(guó)大部分地區(qū)松材線(xiàn)蟲(chóng)具有較高的同源性，從浙江、江蘇和廣西傳入的可能性大。重慶松材線(xiàn)蟲(chóng)來(lái)源于安徽、廣西、浙江和江蘇的可能性較大。山東省松材線(xiàn)蟲(chóng)來(lái)自于日本［87］。以上可能的疫情傳播路徑充分反映了松材線(xiàn)蟲(chóng)病疫情主要依賴(lài)于人為因素傳播而呈現(xiàn)出跳躍式發(fā)展的特點(diǎn)。Cheng等［88］早期采用AFLP對(duì)來(lái)自我國(guó)的松材線(xiàn)蟲(chóng)28個(gè)蟲(chóng)株、美國(guó)4個(gè)蟲(chóng)株和日本2個(gè)蟲(chóng)株的遺傳多樣性分析與可能的傳播路徑分析認(rèn)為，該病的疫情最早起源于廣東，一條傳播路徑是由廣東傳播至安徽、浙江;另一條是由廣東傳入江蘇，再至湖北、重慶、貴州和安徽明光地區(qū)。兩種觀點(diǎn)都認(rèn)為廣東是松材線(xiàn)蟲(chóng)病疫情在我國(guó)流行的一個(gè)重要的傳播源。但也存在差異，后期的研究認(rèn)為江蘇也是該病另外一個(gè)傳播源，造成這種差異的原因可能與疫情后期的進(jìn)一步發(fā)展和樣本收集數(shù)量進(jìn)一步豐富有關(guān)。

松材線(xiàn)蟲(chóng)病疫情數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析也表明，該病在我國(guó)的傳播方式以人為成分為主。人為傳播載體中，37.66%是由于調(diào)運(yùn)感病松木攜帶傳入，41.56%是隨貨物包裝流通傳入，18.18%是由于實(shí)施電網(wǎng)改造工程時(shí)大量電纜盤(pán)攜帶傳入，2.60%是架設(shè)通訊設(shè)備時(shí)光纜盤(pán)攜帶傳入。其在我國(guó)快速擴(kuò)散蔓延是由大量攜帶病原的木包裝材料境外傳入、國(guó)內(nèi)疫區(qū)疫木管理不嚴(yán)、檢測(cè)檢驗(yàn)手段落后、疫情監(jiān)測(cè)不及時(shí)等原因共同造成的［87］。

4 展望

4.1 松材線(xiàn)蟲(chóng)伴生微生物的多樣性 自然界松材線(xiàn)蟲(chóng)存在伴生微生物是一種普遍現(xiàn)象，有關(guān)松材線(xiàn)蟲(chóng)與伴生真菌的研究認(rèn)為伴生真菌在松材線(xiàn)蟲(chóng)病的后期階段松樹(shù)細(xì)胞死亡后可以作為線(xiàn)蟲(chóng)的飼料維持線(xiàn)蟲(chóng)正常的種群繁衍，伴生真菌也可以通過(guò)松材線(xiàn)蟲(chóng)及其傳播媒介在天牛羽化階段實(shí)現(xiàn)真菌生存領(lǐng)域的擴(kuò)展和種群的擴(kuò)張，二者形成互惠關(guān)系［89-92］。關(guān)于細(xì)菌與松材線(xiàn)蟲(chóng)的關(guān)系，特別是與松材線(xiàn)蟲(chóng)致病性的關(guān)系目前還存在爭(zhēng)議，正如前文所述。同時(shí)關(guān)于松材線(xiàn)蟲(chóng)伴生細(xì)菌的攜帶部位，早期的研究認(rèn)為松材線(xiàn)蟲(chóng)的伴生細(xì)菌只分布在松材線(xiàn)蟲(chóng)的體表，而在體內(nèi)沒(méi)有觀察到細(xì)菌的存在［93］。但最近的研究認(rèn)為松材線(xiàn)蟲(chóng)和擬松材線(xiàn)蟲(chóng)的腸道區(qū)內(nèi)均有細(xì)菌的存在，并且從體表無(wú)菌的松材線(xiàn)蟲(chóng)和擬松材線(xiàn)蟲(chóng)分離獲得了線(xiàn)蟲(chóng)體內(nèi)細(xì)菌，包括寡養(yǎng)單胞菌屬Stenotrophomonas和愛(ài)文氏菌屬Ewingella在內(nèi)的細(xì)菌類(lèi)群［94］。但關(guān)于松材線(xiàn)蟲(chóng)體內(nèi)細(xì)菌存在的普遍性與獲取方式以及體內(nèi)細(xì)菌對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)的影響、與線(xiàn)蟲(chóng)的協(xié)同進(jìn)化等諸多方面的研究都有待于進(jìn)一步深入。

4.2 松材線(xiàn)蟲(chóng)的功能基因的研究與利用 松材線(xiàn)蟲(chóng)基因組測(cè)序工作初步完成，測(cè)完18 000多個(gè)基因，為揭示松材線(xiàn)蟲(chóng)的致病基因奠定了重要基礎(chǔ)［39］。為了充分闡明松材線(xiàn)蟲(chóng)病的分子機(jī)制，還有必要在已知基因組信息的基礎(chǔ)上借助松材線(xiàn)蟲(chóng)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與表達(dá)譜分析，特別是結(jié)合該病的病程篩選松材線(xiàn)蟲(chóng)及與寄主互作過(guò)程中的病程相關(guān)效應(yīng)因子，這無(wú)疑是松材線(xiàn)蟲(chóng)致病機(jī)制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前，多種植物寄生線(xiàn)蟲(chóng)大規(guī)模的EST測(cè)序以及cDNA文庫(kù)的測(cè)序?yàn)橹参锛纳€(xiàn)蟲(chóng)致病相關(guān)的基因的研究提供了數(shù)以萬(wàn)計(jì)的表達(dá)序列標(biāo)簽［47，64，66，95］，結(jié)合基因組表達(dá)譜分析及其他模式生物的功能基因注釋信息，獲得了包括果膠裂解酶［66］、多聚葡聚糖醛酸酶［96］、β-1，4-木聚糖酶［97］和 β-1，4-內(nèi)切葡聚糖酶［98］在內(nèi)的大量植物寄生線(xiàn)蟲(chóng)致病相關(guān)基因。其中松材線(xiàn)蟲(chóng)的混合階段、分散型幼蟲(chóng)階段轉(zhuǎn)錄組分析，以及松材線(xiàn)蟲(chóng)和擬松材線(xiàn)蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組的比較分析［95，99］，為松材線(xiàn)蟲(chóng)的致病性、發(fā)育、生態(tài)適應(yīng)性等性狀相關(guān)功能基因的挖掘與利用提供了重要的材料。

隨著松材線(xiàn)蟲(chóng)基因組和轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序，數(shù)據(jù)庫(kù)中積累了大量松材線(xiàn)蟲(chóng)的基因序列信息，但目前僅有非常有限的基因獲得了明確的功能注釋。目前從松材線(xiàn)蟲(chóng)克隆的與致病性相關(guān)的基因主要有細(xì)胞纖維素酶GHF45家族、果膠酶、擴(kuò)展蛋白、毒液過(guò)敏蛋白、過(guò)氧化物還原蛋白等基因［75，79，85，100-101］。關(guān)于這些基因的功能分析大都采用同源性比對(duì)和體外表達(dá)產(chǎn)物的酶學(xué)分析方法進(jìn)行，但這類(lèi)方法只能滿(mǎn)足于某些酶類(lèi)的功能分析，而對(duì)一些非酶類(lèi)的基因功能分析則受到很大限制。此外由于酶學(xué)功能分析大多借助于原核和真核體外表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行，因此也很難完全闡明該基因的確切功能以及該基因在宿主體內(nèi)的差異表達(dá)可能導(dǎo)致宿主的表型變化。近年來(lái)，隨著RNAi干擾技術(shù)在植物線(xiàn)蟲(chóng)基因功能分析方面的應(yīng)用發(fā)展，也被用于松材線(xiàn)蟲(chóng)基因功能的鑒定［55，76，102-104］。盡管目前已經(jīng)有部分學(xué)者開(kāi)展了松材線(xiàn)蟲(chóng)部分催化酶的 RNA 干擾研究［55，103-104］，但還沒(méi)有關(guān)于松材線(xiàn)蟲(chóng)致病相關(guān)基因RNA干擾后松材線(xiàn)蟲(chóng)致病力變化的報(bào)道，特別是干擾后線(xiàn)蟲(chóng)對(duì)松樹(shù)的致病力的變化。此外，目前的報(bào)道大多基于浸泡法進(jìn)行松材線(xiàn)蟲(chóng)的RNA干擾，但由于浸泡法具有不持續(xù)性和干擾效果逐步衰退的劣勢(shì)，使其應(yīng)用受到很大限制。松材線(xiàn)蟲(chóng)有不同于秀麗線(xiàn)蟲(chóng)和其他植物寄生線(xiàn)蟲(chóng)的特性，松材線(xiàn)蟲(chóng)在離體條件下具有取食部分真菌菌絲的特點(diǎn)，這就使得構(gòu)建由真菌介導(dǎo)的高效、穩(wěn)定的RNAi干擾體系成為可能。可被松材線(xiàn)蟲(chóng)取食的真菌包括灰葡萄孢、擬盤(pán)多毛孢、盤(pán)多毛孢等多種真菌［105］。初步研究表明異角狀擬盤(pán)多毛孢真菌遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立為今后探討由真菌飼喂法實(shí)現(xiàn)松材線(xiàn)蟲(chóng)功能基因的持續(xù)高效的RNAi干擾效應(yīng)成為可能［106］。

功能基因的正確表達(dá)調(diào)控作為基因功能實(shí)現(xiàn)的重要方面，siRNA、miRNA及其他小RNA等非編碼RNA參與了生命活動(dòng)的基因的表達(dá)調(diào)控，其中包括轉(zhuǎn)錄、染色體的形成、RNA的剪接和修飾、mRNA的穩(wěn)定和翻譯、蛋白質(zhì)的穩(wěn)定和轉(zhuǎn)運(yùn)，其中miRNA的表現(xiàn)尤為突出。miRNA在動(dòng)植物、微生物的生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖、致病等方面發(fā)揮重要作用。在秀麗新桿線(xiàn)蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)部分miRNA在線(xiàn)蟲(chóng)的發(fā)育過(guò)程具有重要的調(diào)控作用，同時(shí)也為研究線(xiàn)蟲(chóng)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控研究提供了重要借鑒［107-108］。在松材線(xiàn)蟲(chóng)的研究中目前僅見(jiàn)Huang等［109］通過(guò)深度測(cè)序的方法分析了不同地理來(lái)源的松材線(xiàn)蟲(chóng)miRNA，共發(fā)現(xiàn)了810個(gè)miRNA，其中含有保守的miRNA 49個(gè)。miRNA可能在松材線(xiàn)蟲(chóng)的生態(tài)適應(yīng)性和進(jìn)化中具有重要作用。但關(guān)于這些miRNA的靶標(biāo)基因及其對(duì)靶標(biāo)基因的調(diào)控等方面的研究還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。致病相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控研究是研究松材線(xiàn)蟲(chóng)致病分子機(jī)制的重要方面，由于miRNA在基因的表達(dá)調(diào)控方面，尤其是mRNA的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控具有重要的作用，也將是松材線(xiàn)蟲(chóng)致病機(jī)制研究的重要方面。

［1］ 朱克恭，朱正昌，嚴(yán)敖金.松材線(xiàn)蟲(chóng)的流行與研究進(jìn)展［C］.中國(guó)松材線(xiàn)蟲(chóng)病的流行與治理［M］.北京:中國(guó)林業(yè)出版社，1995.

［2］ Khan F A，Gbadegesin R A.On the occurrence of nematode induced pine wilt disease in Nigeria［J］.Pakistan Journal of Nematology，1991(9):57-58.

［3］ Mota M M，Braasch H，Bravo M A，et al.First report of Bursaphelenchus xylophilus in Portugal and in Europe［J］.Nematology，1999，1:727-734.

［4］ 楊寶君，潘宏陽(yáng)，湯堅(jiān)，等.松材線(xiàn)蟲(chóng)病［M］.北京:中國(guó)林業(yè)出版社，2003:6-9.

［5］ Hongtao Niu，Lilin Zhao，Min Lu，et al.The ratio and concentration of two monoterpenes mediate fecundity of the pine wood nematode and growth of its associated fungi［J］.PLoS ONE，2012，7(2):e31716.doi:10.1371/journal.pone.0031716.

［6］ Roriz M，Santos C，Vasconcelos M W.Population dynamics of bacteria associated with different strains of the pine wood nematode Bursaphelenchus xylophilus after inoculation in maritime pine(Pinus pinaster［J］).Experimental parasitology，2011，28(4):357-364.

［7］ Tamura H.Pathogenicity of aseptic Bursaphelenchus xylophilus and associated bacteria to pine seedlings［J］.Jpn Nematology，1983，13:1-5.

［8］ Fukuda K，Hogetsu T，Suzuki K.Cavitation and cytological changes in xylem of pine seedlings inoculated with virulent and avirulent isolates of Bursaphelenchus xylophilus and B．mucronatus［J］.J Jpn For Soc，1992，74(4):289-299.

［9］ Kiyohara T，Tokushige Y.Inoculation experiments of nematode，Bursaphelenchus sp.on pine trees［J］.J Jap For Soc，1971，53(7):210-218.

［10］ Mamiya Y，Kiyohara T.Description of Bursaphelenchus lignicolus n.sp.(Nematoda:Aphelenchoidae)from pine wood and histopathology of nematode-infested trees［J］.Nematologica，1972，18:120-124.

［11］ Bolla I，Jordan W.Cultivation of the pine wilt nematode，Bursaphelenchus xylophilus，in axenic culture media［J］.Journal of Nematology，1982，14(3):377-381.

［12］ Kuroda K，Ito S.Migration speed of pine wood nematodes and activities of other microbes during the development of pine-wilt disease in Pinus thunbergii［J］.J Jpn For Soc，1992，74:383-389.

［13］ Zhu L，Ye J，Negi S，et al.Pathogenicity of aseptic Bursaphelenchus xylophilus［J］.PLoS ONE，2012，7(5):e38095.

［14］ Oku H，Shiraishi T，Kurozumi S.Participation of toxin in wilting of Japanese pines caused by a nematode［J］.Naturwissenschaften，1979，66:210-211.

［15］ Oku H.Pine wilt toxin，the metabolite of a bacterium associated with a nematode［J］.Naturwissenschaften，1980:67:198-199.

［16］ 張建平，趙博光，謝立群.松材線(xiàn)蟲(chóng)病死木中真菌和細(xì)菌的分離［J］.南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2004，28(2):87-89.

［17］ 魯國(guó)華，葉建仁.安徽省馬尾松樹(shù)干內(nèi)真菌種類(lèi)研究［J］.南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2011，35(1):132-134.

［18］ 巨云為，謝立群，楊雪云，等.不同來(lái)源松材線(xiàn)蟲(chóng)攜帶的細(xì)菌多樣性［J］.東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，36(5):84-85.

［19］ 趙博光，郭道森，高蓉，等.細(xì)菌分離物B619與松材線(xiàn)蟲(chóng)病關(guān)系的初步研究［J］.南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，24(4):72-74.

［20］ 趙博光，高蓉，巨云為，等.抗生素對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)病的影響［J］.南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，24(4):75-77.

［21］ 郭道森，趙博光，李榮貴.松材線(xiàn)蟲(chóng)對(duì)其攜帶的一株細(xì)菌繁殖和致病性的影響［J］.應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2006，12(4):523-527.

［22］ 趙博光，趙林果，劉秀華，等.松萎蔫病病原的研究［J］.南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2007，31(4):1-5.

［23］ 趙博光，劉玉濤，林峰.松材線(xiàn)蟲(chóng)與其攜帶細(xì)菌之間的相互影響［J］.南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2005，29(3):1-4.

［24］ Han Z，Hong Y，Zhao B.A study on pathogenicity of bacteria carried by pine wood nematodes［J］.J Phytopathol，2003，151:683-689.

［25］ Zhao B，Lin F.Mutualistic symbiosis between Bursaphelenchus xylophilus and bacteria of the genus Pseudomonas［J］.Forest Pathol，2005，35:339-345.

［26］ Zhao B G，Liu Y，Lin F.Effects of bacteria associated with pine wood nematode(Bursaphelenchus xylophilus)on development and egg production of the nematode［J］.J Phytopathology，2007，155(1):26-30.

［27］ Maehara N，Aikawa T，Kanzaki N.Inoculation of several Bursaphelenchus xylophilus group nematodes into adult trees of Pinus thunbergii and their survival in the tree［J］.For Path，2011，41:477-481.

［28］ Takeuchi Y，F(xiàn)utai K.Avirulent isolate of the pine wood nematode Bursaphelenchus xylophilus，survives 7 months in asymptomatic host seedlings［J］.For Path，2007，37:289-291.

［29］ Kiyohara T，Bolla R I.Pathogenic variability among populations of the pine wood nematode，Bursaphelenchus xylophilus［J］.Forest Science，1990，4(36):1061-1076

［30］ 張治宇，張克云，林茂松，等.不同松材線(xiàn)蟲(chóng)群體對(duì)黑松的致病性測(cè)定［J］.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，2(25):43-46.

［31］ 黃麟，葉建仁，劉雪蓮.松材線(xiàn)蟲(chóng)病病原種群分化研究現(xiàn)狀［J］.南京林業(yè)大學(xué):自然科學(xué)版，2009，33(4):135-139.

［32］ 劉雪蓮.中國(guó)松材線(xiàn)蟲(chóng)群體形態(tài)學(xué)及致病性變異的研究［D］.南京:南京林業(yè)大學(xué)，2007:35-50.

［33］ 洪英娣，曹越，趙博光，等.松材線(xiàn)蟲(chóng)攜帶細(xì)菌的鑒定和毒性研究［J］.南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2002，26(5):37-40.

［34］ 談家金，向紅瓊，馮志新.松材線(xiàn)蟲(chóng)伴生細(xì)菌的分離鑒定及其致病性［J］.林業(yè)科技開(kāi)發(fā)，2008，22(2):23-26.

［35］ Proenca D N，F(xiàn)rancisco R，Santos C V，et al.Diversity of bacteria associated with Bursaphelenchus xylophilus and other nematodes isolated from Pinus pinaster trees with pine wilt disease［J］.PLoS ONE，2010，5(12):e15191.

［36］ Van der Stoel C D，Van der Putten W H.Pathogenicity and host range of Heterodera arenaria in coastal foredunes［J］.Nematology，2006，8:255-263.

［37］ Melakeberhan H.Pathogenicity of Pratylenchus penetrans，Heterodera glycines and Meloidogyne incognita on Soybean Genotypes［J］.J Nematol，1998，30(1):93-99.

［38］ Baum T J，Hussey R S，Davis E L.Root-knot and cyst nematode parasitism genes:the molecular basis of plant parasitism［J］.Genetic Engineering，2007，28:17-43.

［39］ Kikuchi T，Cotton JA，Dalzell JJ，et al.Genomic insights into the origin of parasitism in the emerging plant pathogen Bursaphelenchus xylophilus［J］.PLoS Pathog，2011，7(9):e1002219.

［40］ Endo B Y.Ultrastructure of esophageal gland secretoy granules in juveniles of Heterodera glycines［J］.The Journal of Nematology，1987，19:469-483.

［41］ Hussey R S.Disease-inducing secretions of plant-parasitic nematodes［J］.Annual Review Phytopathology，1989，27:123-141.

［42］ Davis E L，Hussey R S，Baum T J，et al.Nematode parasitism genes［J］.Annual Review of Phytopathology，2000，38:365-396.

［43］ Bird A F.Changes in the dimensitons of the oesophageal glands in root-knot nematodes during the onset of parasitism［J］.International Journal for Parasitology，1983，13:343-348.

［44］ Tytgat T，de Meutter J，Vanholme B，et al.Development and pha-ryngeal gland activities of Heterodera schachtii infecting Arabidopsis thaliana roots［J］.Nematology，2002，4:899-908.

［45］ de Boer J M，Yan Y，Smant G，et al.In situ hybridization to messenger RNA in Heterodera glycines［J］.The Journal of Nematology，1998，30(3):309-312.

［46］ Goverse A，Aavis E L，Hussey R S.Monoclonal antibodies to the esophageal glands and stylet secretions of Heterodera glycines［J］.Journal of Nematology，1994，26:251-259.

［47］ Huang G Z，Gao B，Maier T，et al.A profile of putative parasitism genes expressed in the esophageal gland cells of the rootknot nematode Meloidogyne incognita［J］.Molecular Plant Microbe Interactions，2003，16(5):376-381.

［48］ Boccara M，Aymeric J L，Camus C.Role of endoglucanases in Erwinia chrysanthemi 3937 virulence on Saintpaulia ionantha［J］.J Bacteriol，1994，176:1524-1526.

［49］ Mendgen K，Hahn M，Deising H.Morphogenesis and mechanisms of penetration by plant pathogenic fungi［J］.Annu Rev Phytopathol，1996，34:367-386.

［50］ Goellner M，Smant G，De Boer J M，et al.Isolation of beta-1，4-endonglucanase genes from Globodera tabacum and their expression during parasitism［J］.The Journal of Nematology，2000，32:154-165.

［51］ Goellner M，Wang X，Davis E L.Endo-β-1，4-glucanase expression in compatible plant nematode interactions［J］.Plant Cell，2001，13:2241-2255.

［52］ Uehara T，Kushida A，Momota Y.PCR-based cloning of two beta-1，4-endoglucanases from the root-lesion nematode Pratylenchus penetrans［J］.Nematology，2001，3:335-341.

［53］ 黃麟.基于SSH的松材線(xiàn)蟲(chóng)致病相關(guān)基因克隆與分子標(biāo)記［D］.南京:南京林業(yè)大學(xué)，2009:37-38.

［54］ Shibuya H，Kikuchi T.Purification and characterization of recombinant endoglucanases from the pine wood nematode Bursaphelenchus xylophilus［J］.Bioscience，Biotechnology and Biochemistry，2008，72(5):1325-1332.

［55］ Cheng X，Dai S，Xiao Luo，et al.Influence of cellulase gene knockdown by dsRNA interference on the development and reproduction of the pine wood nematode，Bursaphelenchus xylophilus［J］.Nematology，2010，12(2):225-233.

［56］ Castresana C，de Carvalho F，Gheysen G，et al.Tissue-specific and pathogen-induced regulation of a Nicotiana plumbaginifolia β-1，3-glucanase gene［J］.Plant Cell，1990，2:1131-1143.

［57］ Watanabe T，Kasahara N，Aida K，et al.Three N-terminal domains of β-1，3-glucanase A1 are involved in binding to insoluble β-1，3-glucan［J］.J Bacteriol，1992，174:186-190.

［58］ de la Cruz J，Pintor-Toro J A，Benitez T，et al.A novel endo-β-1，3-glucanase，BGN13.1，involved in the mycoparasitism of Trichoderma harzianum［J］.J Bacteriol，1995，177:6937-6945.

［59］ Bachman E S，McClay D R.Molecular cloning of the first metezoan β-1，3 glucanase from eggs of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus［J］.PNAS，1996，93:6808-6813.

［60］ Dimopoulos G，Richman A，Muller H M，et al.Molecular immune responses of the mosquito Anopheles gambiae to bacteria and malaria parasites［J］.PNA，1997，94:11508-11513.

［61］ Kikuchi T，Shibuya H，Jones J T.Molecular and biochemical characteri-zation of an endo-β-1，3-glucanase from the pinewood nematode Bursaphelenchus xylophilus acquired by horizontal gene transfer from bacteria［J］.Biochem J，2005，389:117-125.

［62］ Carpita N C，Gibeaut D M.Structural models of primary cell walls in flowering plants:consistency of molecular structure with the physical properties of the walls during growth［J］.Plant J，1993，3(1):1-30.

［63］ Barras F，van Gijsegem F，Chatterjee A K.Extracellular enzymes and soft-rot Erwinia［J］.Annual Reviews on Phytopathology，1994，32:201-234.

［64］ de Boer J M，Davis E L，Hussey R S，et al.Cloning of a putative pectate lyase gene expressed in the subventral esophageal glands of Heterodera glycines［J］.Nematology，2002，34(1):9-11.

［65］ Doyle E A，Lambert K N.Cloning and characterization of an esophageal-gland-specific pectate lyase from the root-knot nematode Meloidyne javanica［J］.Molecular Plant-Microbe Interactions，2002，15:549-556.

［66］ Popeijus H，Overmas H，Joes J，et al.Degradation of plant cell walls by a nematode［J］.Nature，2000，406:36-37.

［67］ Kikuchi T，Shibuya H，Aikawa T，et al.Cloning and characterization of pectate lyases expressed in the esophageal gland of the pine wood nematode Bursaphelenchus xylophilus［J］.Molecular Plant-Microbe Interactions，2006，19(3):280-287.

［68］ Waetzig G H，Sobczak M，Grundler F M W.Localization of hydrogen peroxide during the defence response of Arabidopsis thaliana against the plant-parasitic nematode Heterodera glycines［J］.Nematology，1999，1:681-686.

［69］ Baker C J，Orlandi E W.Active oxygen in plant pathogenesis［J］.Annu Rev Phytopathol，1995，33:299-321.

［70］ LoVerde P T.Do antioxidants play a role in schistosome hostparasite interactions? ［J］.Parasitol Today，1998，14:284-289.

［71］ Robertson L，Robertson W M，Sobczak M，et al.Cloning，expression and functional characterisation of a peroxiredoxin from the potato cyst nematode Globodera rostochiensis［J］.Molecular and Biochemical Parasitology，2000，111(1):41-49.

［72］ Netto L E S，Chae H Z，Kang S W，et al.Removal of hydrogen peroxide by thiol-specific antioxidant enzyme(TSA)is involved with its antioxidant properties［J］.J Biol Chem，1996，271:15315-15321.

［73］ Jaeger T，F(xiàn)lohe L.The thiol-based redox networks of pathogens:unexploited targets in the search for new drugs［J］.Biofactors，2006，27:109-120.

［74］ Pedrajas JR，Miranda Vizuete A，Javanmardy N，et al.Mitochondria of Saccharomyces cerevisiae contain one-conserved cysteine type peroxiredoxin with thioredoxin peroxidase activity［J］.J Biol Chem，2000，275:16296-16301.

［75］ Li Z，Liu X，Chu Y，et al.Cloning and characterization of a 2-Cys peroxiredoxin in the Pine Wood Nematode，Bursaphelenchus xylophilus，a putative genetic factor facilitating the infestation［J］.International Journal of Biological Sciences，2011，7(6):823-836.

［76］ Cho H T，Cosgrove D J.Regulation of root hair initiation and expansin gene expression in Arabidopsis［J］.Plant Cell，2002，14(12):3237-3253.

［77］ Pezzotti M，Teron R，Mariani C.Pollination modulates expression of the PPAL gene，a pistil-specific β-expansins［J］.Plant Molecular Biology，2002，49(2):187-197.

［78］ Griesser M，Grundler F M W.Quantification of tomato expansins in nematode feeding sites of cyst and root-knot nematodes［J］.Journal of Plant Diseases and Protection，2008，115:263-272.

［79］ Kikuchi T，Li H，Karim N，et al.Identification of putative expansin-like genes from the pine wood nematode，Bursaphelenchus xylophilus，and evolution of the expansin gene family within the Nematoda［J］.Nematology，2009，11(3):355-364.

［80］ Chalmers I W，McArdle A J，Coulson R M，et al.Developmentally regulated expression，alternative splicing and distinct subgroupings in members of the Schistosoma mansoni venom allergen-like(SmVAL)gene family［J］.BMC Genomics，2008，9:89.

［81］ Yamazaki Y，Brown R L，Morita T.Purification and cloning of toxins from elapid venoms that target cyclic nucleotide-gated ion channels［J］.Biochemistry，2002，41(38):11331-11337.

［82］ Wang X，Li H，Hu Y，et al.Molecular cloning and analysis of a new venom allergen-like protein gene from the root-knot nematode Meloidogyne incognita［J］.Exp Parasitol，2007，117:133-140.

［83］ Ding X，Shields J，Allen R，et al.Molecular cloning and characterisation of a venom allergen AG5-like cDNA from Meloidogyne incognita［J］.Int J Parasitol，2000，30:77-81.

［84］ Gao B，Allen R，Maier T，et al.Molecular characterisation and expression of two venom allergen-like protein genes in Heterodera glycines［J］.Int J Parasitol，2001，31，1617-1625.

［85］ Lin S，Jian H，Zhao H，et al.Cloning and characterization of a venom allergen-like protein gene cluster from the pinewood nematode Bursaphelenchus xylophilus［J］.Exp Parasitol，2011，127(2):440-447.

［86］ 潘宏陽(yáng)，葉建仁，吳小芹.中國(guó)松材線(xiàn)蟲(chóng)病空間分布格局［J］.生態(tài)學(xué)報(bào)，2009，29(8):4325-4331.

［87］ 潘宏陽(yáng).松材線(xiàn)蟲(chóng)病在中國(guó)的流行與病原群體變異研究［D］.南京:南京林業(yè)大學(xué)，2007.

［88］ Cheng X，Cheng F，Xu R，et al.Genetic variation in the invasive process of Bursaphelenchus xylophilus(Aphelenchida:Aphelenchoididae)and its possible spread routes in China［J］.Heredity，2008，100:356-365.

［89］ Yakaoka Y，Masuya H，Ohtaka N.Three new Ophiostoma species with Pesotum anamorphs associated with bark beetles infesting Abies species in Niko，Japan［J］.Mycoscience，2004，45:277-286.

［90］ Fukushigi H.Propagation of Bursaphelenchus xylophilus(Nematoda:Aphelenchoididae)on fungi growing in pine-shoot segments［J］.Applied Entomology and Zoology，1991，26:371-376.

［91］ Noritoshi M，Kazuyoshi F.Factors affecting both the numbers of Bursaphelenchus xylophilus carried by several species of beetles［J］.Nematology，2002，4:653-658.

［92］ 田雪亮，茆振川，陳國(guó)華，等.松材線(xiàn)蟲(chóng)與伴生微生物的生態(tài)關(guān)系［J］.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2011，22(3):810-815.

［93］ 趙博光，郭道森，高蓉.松材線(xiàn)蟲(chóng)攜帶細(xì)菌部位的電鏡觀察［J］.南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，24(4):69-71.

［94］ 袁為敏，吳小芹，葉建仁，等.松材線(xiàn)蟲(chóng)和擬松材線(xiàn)蟲(chóng)體內(nèi)細(xì)菌的透射電鏡觀察及分離鑒定［J］.微生物學(xué)報(bào)，2011，51(8):1071-1077.

［95］ Kikuchi T，Aikawa T，Kosaka H，et al.Expressed sequence tag(EST)analysis of the pine wood nematode Bursaphelenchus xylophilus and B．mucronatus［J］.Molecular and Biochemical Parasitology，2007，155:9-17.

［96］ Jaubert S，Ledger T N，Laffaire J B，et al.Direct identification of stylet secreted proteins from root-knot nematodes by a proteomic approach［J］.Molecular and Biochemical Parasitology，2002，121:205-211.

［97］ Dautova M，Rosso M N，Abad P，et al.Single pass cDNA sequencing-a powerful tool to analyse gene expression in preparasitic juveniles of the southern root-knot nematode Meloidogyne incogneta［J］.Nematology，2001，3:129-139.

［98］ Gao B，Allen R，Maier T，et al.Identification of putative parasitism genes expressed in the esophageal gland cells of the soybean cyst nematode Heterodera glycines［J］.Mol Plant-Microbe Interact，2001，14:1247-1254.

［99］ Yan X，Cheng X，Wang Y，et al.Comparative transcriptomics of two pathogenic pinewood nematodes yields insights into parasitic adaptation to life on pine hosts［J］.Gene，2012，505(1):81-90.

［100］ Jones J T，Moens M，Mota M，et al.Bursaphelenchus xylophilus:opportunities in comparative genomics and molecular hostparasite interactions［J］.Molecular Plant Pathology，2008，9(3):357-368.

［101］ Kikuchi T，Jones J T，Aikawa T，et al.A family of glycosyl hydrolase family 45 cellulases from the pine wood nematode Bursaphelenchus xylophilus［J］.FEBS Letters，2004，572:201-205.

［102］王守先，牛寶龍，沈衛(wèi)鋒，等.松材線(xiàn)蟲(chóng)RNA聚合酶基因的RNA干擾研究［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007(7):690-694.

［103］ Ma H B，Lu Q，Liang J，et al.Functional analysis of the cellulose gene of the pine wood nematode，Bursaphelenchus xylophilus，using RNA interference［J］.Genet Mol Res，2011，10(3):1931-1941.

［104］ Kang J S，Koh Y H，Moon Y S，et al.Molecular properties of a venom allergen-like protein suggest a parasitic function in the pinewood nematode Bursaphelenchus xylophilus［J］.Int J Parasitol，2012，42(1):63-70.

［105］瞿紅葉，談家金，葉建仁，等.不同真菌對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)繁殖及致病力的影響［J］.南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2009，33(6):57-59.

［106］張林平，葉建仁，李月陽(yáng)，等.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的異角狀擬盤(pán)多毛孢菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)研究［J］.南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2012，36(1):28-32.

［107］ Lee R C，F(xiàn)einbaum R L，Ambros V.The C．elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14［J］.Cell，1993，75:843-854.

［108］ Reinhart B J，Slack F J，Basson M，et al.The 21-nucleotide let-7 RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans［J］.Nature，2000，403:901-906.

［109］ Huang Q X，Cheng X Y，Mao Z C，et al.MicroRNA disco-very and analysis of pinewood nematode Bursaphelenchus xylophilus by deep sequencing［J］.PLoS ONE，2010，5(10):e13271.doi:10.1371/journal.pone.0013271.