GABRA3基因rs12688628位點G/T多態性與甲亢性低鉀性周期性麻痹的相關性研究

羅成宏，崔玉真，朱東銘，朱永瑤，付倫姣，楊 媚，蘇斌儒，陳月富，陸偉恒，許鵬杰，肖 波

甲狀腺功能亢進性周期性麻痹(Thyrotoxic Hypokalemic Periodic Paralysis，THPP)是以突發、復發及可逆發作的肌肉無力為特征的一種疾病，作為甲狀腺功能亢進的并發癥，THPP在西方國家很少發生，但在亞洲男性中，發病率可達10%［1］。至今為止，THPP中男性占優勢以及種族差異的原因仍然令人費解。GABRA3基因為編碼GABA受體α3亞單位的基因，是氯通道蛋白家族的一員，該基因高度表達于神經細胞和神經肌肉接頭處，且另有研究表明GABRA3表達于骨骼肌的多個位點，其基因突變有可能影響了神經肌肉接頭處遞質的傳遞，從而導致乏力的發生。有趣的是GABRA3基因位于X染色體上，該基因與THPP的男性優勢發病有無內在聯系，值得我們進一步探討。本研究選取GABRA3基因3號內含子rs12688628(G/T)多態性與中國南方男性甲亢性周期性麻痹的的相關性進行了探討。

1 資料與方法

1．1 研究對象 本研究選取本院神經內科、內分泌門診及住院男性患者，根據典型臨床表現，甲狀腺功能測定結果及血鉀測定結果，分成THPP組(35例)、GD組(35例)，HPP組(25例)，其中包括腎小管酸中毒3例，原發性醛固酮增多癥4例，嗜鉻細胞瘤3例，家族性低鉀周期性麻痹2例，原因不明低鉀周期性麻痹13例，以及另選健康人群組成NC組(35例)。THPP組患者，年齡17～56歲，平均29．81±10．26歲，診斷標準:(1)甲亢的臨床表現及甲狀腺功能檢測TSH↓，FT4、FT3↑;(2)急性肌無力(不能行走);(3)發作時血 K+＜3．5mmol/L;(4)排除其他導致低鉀血癥疾病所致的低鉀性麻痹。HPP組患者，年齡21～62歲，平均 31．15±12．26歲，診斷標準:(1)急性肌無力(不能行走);(2)發作時血K+＜3．5mmol/L;(3)排除利尿劑、瀉藥、激素等藥物以及甲狀腺功能亢進導致的低鉀周期性麻痹。GD組患者，年齡 20～60歲，平均 30．27±11．74歲，Graves’病診斷標準:(1)甲狀腺功能亢進診斷成立;(2)甲狀腺腫大成彌漫性;(3)無低鉀性麻痹的臨床表現，血鉀在正常范圍(3．5～5．5mol/L)，無低鉀及癱瘓發生。NC組，年齡19～53歲，平均27．19±10．43歲，主要來源于本院職工、學生及體檢中心相匹配的健康人群。常規體檢TSH、FT4正常(0．27＜TSH ＜4．2mU/L，12．0 ＜FT4 ＜22pmol/L)，并且排除高血壓病、心、肝、肺、腎腫瘤等疾病，無甲狀腺功能亢進或低鉀周期性麻痹家族史。入選對象均為來自廣東、廣西、江西、湖南、四川、福建等省無血緣關系的漢族人群，4組患者年齡差異無統計學意義(P＞0．05)。

1．2 實驗方法

1．2．1 DNA 的提取 EDTA抗凝全血5ml，置于－80℃冰箱保存，后集中標本使用BloodZol試劑盒提取DNA。

1．2．2 GABRA3基因多態性分析 使用巢式PCR擴增包含rs12688628片段。一次PCR(目的片段)，引物序列為 F:5’TTTCTATGAGGCTGGCTAT 3’;R:5’TAAACAGGTTGCTTACGG 3’。DNA 樣本經 HhaI(Promega，HhaI，10U，10g/L 牛血清蛋白0．2μl，10 ×緩沖液2μl，DNA 樣品 10μl，加去離子水至總體積20μl)37℃消化3h后;65℃孵育 20min以終止反應;然后在 PT-200型熱循環儀上進行巢式PCR擴增．反應體系為 50μl，含10mmo l/L dNTP(GibcoBRL)4μl，10 × 緩沖液 5 μl，50mmo l/LMgC l 1．5μl，Taq DNA 聚 合酶(G ibcoBRL)1．25U，20pmol/L引物 1 μl，DNA 樣 品 5 μl．。95℃ 5 m in預變性后，95℃變性30s，58℃淬火 2 0s，72℃ 延長 1 min，共 1 5個循環，72℃延長 10min;二次 PCR(目的片段140bp)，引物序列:F:5’AGTGATGGCACAAGAATCAGTCCTT 3’;R:5’CAGATGTTTCATTCTTAATG 3’。反應結束后取PCR產物配成酶切反應體系，其中 P CR 產 物10μl、緩沖液2μl、內切酶 3 U，加 d dH2O至20μl體系，37℃酶切4h，65℃ 10min 終止酶切反應，內切酶為EcoNI(NEB R0521L)，25g/L瓊脂糖凝膠電泳觀察電泳圖譜進行基因分型。

1．3 統計學方法 采用SPSS13．0統計軟件和遺傳學數理統計方法進行統計分析，所得數據以±s表示，兩組間均數比較采用t檢驗及方差分析。基因型在發病危險性中的比較均使用χ2檢驗/Fisher確切概率法檢驗。比值比(odds radio，OR)估計等位基因型對 THPP發病的相對危險性，按 Hardy-Weiberg平衡法檢測樣本的群體代表性。P≤0．05示差異有統計學意義。

2 結果

2．1 GABRA3基因DNA提取結果及巢式PCR擴增目的片段 見圖1。

圖1 GABRA3基因DNA提取結果及巢式PCR擴增目的片段圖

表1 THPP組、HPP組、DG組及NC組患者一般情況分析表

表2 THPP組與其他對照組在rs12688628位點的基因型比較

2．2 基因擴增酶切產物結果 本研究研究對象為男性，GABRA3基因位于X染色體上，因此每個個體均只有1個等位基因，基因型分為兩型。rs12688628 PCR產物酶切后呈2種等位基因型。突變不被酶切(保持140bp)，為T基因型，沒有突變被酶切成113bp及27bp兩條帶，為 G型，因27bp太小，瓊脂糖電泳無法檢測到，故以上基因型的條帶相應減少1條。

圖2 瓊脂糖凝膠電泳檢測GABRS基因內含子rs12688628擴增酶切產物圖

2．3 各組患者臨床特征 如表1所見。4組患者年齡組間比較無統計學意義。發作時，THPP組與HPP組血鉀水平均明顯低于正常水平(3．5mmol/L)，兩組間差異無統計學意義?；A狀態下(THPP組與HPP組為補鉀后或未發作時)，THPP組、HPP組與GD組兩組間比較沒有統計學意義;THPP組的TSH與HPP組、NC組比較明顯降低，差異有統計學意義(均為P＜0．05)，GD組與HPP組、NC組比較也是降低的，有統計學意義(均為P＜0．05)，其他兩組間無統計學意義;THPP組FT4與其他3組相比明顯升高，差異有統計學意義(均為P＜0．05)。GD組與HPP組、NC組比較同樣是升高的，有統計學意義(均為P＜0．05)。其他兩兩組間無統計學意義;THPP組FT3與HPP組比較是升高的，差異有統計學意義(P＜0．05)，GD組與HPP組比較也是升高的，有統計學意義(P＜0．05)，而其他兩組間無統計學意義。

2．4 4組患者等位基因頻率比較 按Hardy-Weinberg平衡定律對研究總人群基因頻率進行平衡檢驗 χ2=3．62，df=1，P ＞ 0．05，同時對 THPP 組、HPP組、DG組及NC組進行平衡檢驗顯示，THPP組χ2=0．75，df=1，P ＞0．25;HPP 組 χ2=0．64，df=1，P＞0．5，DG 組 χ2=0．74，df=1，P ＞0．25，NC 組 χ2=0．44，df=1，P ＞0．5，均符合 Hardy-Weinberg 平衡。由表2可見rs12688628位點THPP組G等位基因頻率均高于其他組，與DG組、NC組有顯著差異，但與HPP組無顯著差異，rs12688628位點G等位基因攜帶者相對GD組患THPP的危險性顯著增高(OR=15．13)，相對 NC組患病危險性也增高(OR=5．56)。

3 討論

近年來基因多態性與THPP的相關性研究主要集中在3個通道蛋白基因:CACNA1S、SCN4A、KCNE3，分別為編碼骨骼肌Ca2+通道、Na+通道和K+通道的基因。編碼CACNA1S的基因被確認為是家族性低鉀性周期性麻痹(Family hypokalemic Periodic Paralysis，FHPP)的致病基因，其具有3個錯義突變R528H、R1239H、R1239G［2］，但是在 THPP 的研究中未發現這3個位點的突變［3，4］。研究者們在進一步的研究中發現THPP患者CACNA1S基因11號外顯子具有基因多態性，Kung AW等［5］在研究中國香港地區人群97例THPP患者CACNAIS基因11號外顯子的多態性時，發現了1491AAC/AAT、1551GGT/GGC、1564CGT/TTG。1551T→C的等位基因C頻率分別為 17%(THPP)、19%(GD)和 44%(NC)，1564C→T的等位基因T頻率分別為2%(THPP)、3%(GD)和4%(NC)，但 THPP組與 Graves’病組及正常對照組相比，兩個多態位點均無統計學意義。在SCN4A、KCNE3的基因突變研究中未發現陽性結果。

本研究發現THPP組rs12688628的G等位基因高于NC組、GD組，且有統計學意義，與泰國Jongjaroenprasert等人報道［6］一致。rs12688628 基因位點的多態性位于X染色體GABRA3基因的3號內含子中，眾所周知，THPP多發生于男性，X染色體基因的多態性也許可部分解釋這種臨床特征。該位點與THPP的相關性提示可能附近存在其他的致病等位基因，或者該位點本身就是THPP的致病易感基因，這種多態性可以調節GABRA3或附近基因的表達。以往有多囊卵巢的內含子基因可通過表達后調節另一個下游基因的表達導致該病發生的報道。GABRA3基因是氯通道蛋白家族的一員。該基因高度表達于神經元及神經肌肉接頭處，它的突變在Rett綜合征中有所報道［7］，在基因表達庫中，也明確指出GABRA3可表達于骨骼肌的多個位點［8］。甲狀腺功能亢進本身被認為是THPP患者發病的一個始動因素。有動物實驗證明甲狀腺素水平可影響GABAR基因分子的轉錄，影響其與GABA受體在神經元組織及神經肌肉接處的結合位點［9］，然而目前還沒有體內實驗直接證實甲狀腺素對肌細胞中GABA受體表達的影響，因此GABA受體在THPP患者中的作用還不明了，功能研究有待展開進一步闡述。

與HPP組相比，雖THPP組G等位基因頻率高于后者，但統計分析比較無明顯差異，該結果也許提示GABRA位點的多態性使眾多原因導致的低鉀性周期性麻痹患者殊途同歸，簡言之，GABRA的位點多態性使患者易患低鉀性麻痹，但尚需進一步分子生物學研究證實。

綜上所述，在中國南方漢族人群中發現GABRA3基因 rs12688628(G/T)位點多態性與THPP發病相關，GABRA3基因可能是THPP的易感基因，但這一結論尚需更大的樣本、家系研究來加以驗證。

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