雄激素對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響

李 婛， 季 興， 曾 麗， 李 偉， 楊淑青

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病，以分散性脫髓鞘、軸索損傷和炎癥活動(dòng)為特征［1］。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，女性患病率高于男性，而且癥狀還和體內(nèi)雌激素水平變化相關(guān)［2，3］。近年來，有研究顯示，雄激素對(duì) MS具有一定的治療作用［3，4］。星形膠質(zhì)細(xì)胞在炎性脫髓鞘疾病中明顯活化，在MS和EAE發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［5］。本研究采用實(shí)驗(yàn)性自身免疫性脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)大鼠模型觀察雄激素對(duì)大鼠EAE中樞神經(jīng)系統(tǒng)星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響來探討其中部分作用機(jī)制。

1 材料和方法

1．1 試劑 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的烏拉坦，完全弗式佐劑(CFA，Sigma公司提供，含卡介苗5mg/ml)、卡介苗(衛(wèi)生部上海生物制品研究所)、丙酸睪酮注射液(天津金耀氨基酸有限公司)、免疫試劑中(原裝進(jìn)口分裝)已稀釋的即用型膠原纖維酸性蛋白 (glialfibrillary acidic protein，GFAP)Ⅰ 抗(2．5ml)，Ⅱ抗為(原裝進(jìn)口分裝)生物素化羊抗兔IgG 1 支(濃度 1．5mg/ml，稀釋比為 1∶300 ～1∶500)50μl+抗體稀釋液20ml，鏈霉親和素抗生物素蛋白-過氧化酶免復(fù)合物1支(濃度1μmol/L，稀釋比1∶50～1∶200)100μl，DAB 顯色液 5m(均由北京博奧森提供)。

1．2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康純種遠(yuǎn)交雌性Wistar大鼠50只，8～10周齡，體質(zhì)量180～220g，采取隨機(jī)數(shù)字表分發(fā)，分為生理鹽水對(duì)照組(對(duì)照組，10只)、EAE模型組(模型組，20只)和丙酸睪酮干預(yù)組(雄激素干預(yù)組，20只)。成年豚鼠8只，雌雄不限，體質(zhì)量300～400g。所有動(dòng)物均由廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，置于恒溫恒濕的環(huán)境，分籠飼養(yǎng)，每籠2～3只，自由攝食和飲水。

1．3 實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎模型制備參考文獻(xiàn)［5］方法，將豚鼠斷頭處死，剪開枕骨及椎管剝離脊髓，去掉馬尾與脊髓膜。稱重，加入等量的生理鹽水，用勻漿機(jī)(YQ-3，日本株式社會(huì))制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%的脊髓勻漿(GPSCH)。再與等量的CFA(每毫升含卡介苗5mg)混勻后制成油包水型乳劑，置于4℃冰箱備用。模型組與治療組(雄激素干預(yù)組)均在足底真皮下及頸部3點(diǎn)共注射0．5ml GPSCH+CFA。對(duì)照組，在足底真皮下及頸部3點(diǎn)共注射0．5ml NS+CFA。

1．4 試驗(yàn)動(dòng)物分組及處理 隨機(jī)將大鼠分為3組，分別為對(duì)照組10只，模型組20只，治療組20只。(1)對(duì)照組:生理鹽水加完全弗式佐劑作為免疫原誘導(dǎo)造模后，腹腔注射無菌生理鹽水。(2)模型組:EAE模型建立后，腹腔注射無菌生理鹽水。(3)干預(yù)組:EAE模型建立后，腹腔注射丙酸睪酮。以致敏當(dāng)日為第0天，對(duì)照組與模型組于致敏當(dāng)日腹腔注射無菌生理鹽水，按2ml/kg劑量給予。干預(yù)組于致敏當(dāng)日腹腔注射丙酸睪酮，按2ml/kg劑量給予。

1．5 臨床評(píng)分 EAE神經(jīng)功能缺損評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):0分，未發(fā)病;1分，動(dòng)物尾部無力;2分，動(dòng)物尾部無力+前肢或后肢中等無力;3分，前肢或后肢嚴(yán)重?zé)o力，將鼠翻倒后不能復(fù)位;4分，肢體癱瘓，將鼠翻倒后不能復(fù)位;5分，瀕死狀態(tài)。其中1～5分為實(shí)驗(yàn)成功模型。規(guī)定致敏當(dāng)日為第0天，并在每日早晚各兩次觀察動(dòng)物行為學(xué)方面的變化，予以詳細(xì)記錄，同時(shí)每天測(cè)一次體重。于21d時(shí)全部處死。

1．6 免疫組化方法檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP處死后的模型組與治療組評(píng)分在1分及以上已取血的大鼠，正常組在免疫以后21d統(tǒng)一處死，取大腦、腦干和脊髓放在濃度為10%的甲醛中固定，然后包埋，切片，常規(guī)HE染色，砂羅硌花青法髓鞘染色，以及免疫組化染色，采取SP法:大腦、腦干和脊髓的石蠟切片，10μm厚，脫蠟后，檸檬酸高壓抗原修復(fù)，在加入3%H2O2室溫處理，正常血清封閉后，一次滴加一抗(1∶200稀釋)，4℃過夜，生物素標(biāo)記二抗，室溫下孵育15min，辣根酶標(biāo)記的鏈卵白素室溫下孵育15min，DAB染色，顯微鏡下觀察，顯色2～10min，中性膠封片，各步前均用0．01mol/L PBS(pH 7．2～7．5)沖洗5min×3次。圖像處理:每個(gè)動(dòng)物取3張切片，每個(gè)切片隨機(jī)取互不重疊的3個(gè)視野，采用德國LEICA公司生產(chǎn)的病理分析儀(型號(hào):DMR+Q550)對(duì)圖像進(jìn)行分析，計(jì)算大腦、腦干、脊髓各部位GFAP的陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)(個(gè)/視野)。

2 結(jié)果

2．1 建模情況 模型組大鼠平均于免疫后13d開始發(fā)病，治療組平均于免疫后17d開始發(fā)病，發(fā)病表現(xiàn)為活動(dòng)減少、進(jìn)食少、精神不振、體重減輕，先出現(xiàn)尾肌力降低，尾巴拖地不能抬起，繼而后肢無力、癱瘓。如表1所示，治療組的發(fā)病率40%，模型組的發(fā)病率為60%。治療組的潛伏期(20．87±1．13d)，比模型組的潛伏期(18．11 ±1．34d)延長，二者比較差異有顯著性(P＜0．05)。治療組的臨床評(píng)分(1．56±0．99 分)比模型組的臨床評(píng)分(1．87 ±0．73分)低，但二者比較差異無顯著性(P＞0．05)。這些結(jié)果表明處理組的雄激素干預(yù)可以延遲發(fā)病，降低發(fā)病率，但對(duì)病情嚴(yán)重程度無明顯改善。

表1 3組大鼠的行為學(xué)觀察(±s)

表1 3組大鼠的行為學(xué)觀察(±s)

組別 動(dòng)物數(shù) 發(fā)病數(shù)(%) 潛伏期(d)臨床評(píng)分(分)正常對(duì)照組模型組雄激素干預(yù)組10 20 20 0－0 12(60%)8(40%)18．11 ±1．34 20．87 ±1．13 1．87 ±0．73 1．56 ±0．99

2．2 病理學(xué)改變 HE染色觀察發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠在發(fā)病后，大腦、腦干和脊髓內(nèi)可見有大量淋巴細(xì)胞浸潤，聚集在小血管周圍呈袖套樣改變;雄激素干預(yù)組)仍可見炎癥細(xì)胞浸潤，以及“袖套樣”改變，但明顯少于模型組。炎性細(xì)胞浸潤以腦干最明顯，其次為脊髓，大腦最少。HE染色發(fā)現(xiàn)，發(fā)病的大鼠腦和脊髓結(jié)構(gòu)疏松，呈彌漫性脫髓鞘改變。結(jié)果表明，干預(yù)組大鼠的病理改變與模型組相比較，有不同程度的減輕。而正常對(duì)照組未見異常改變。這些結(jié)果與上述行為學(xué)觀察相一致，表明成功建模，而且雄激素具有明顯干預(yù)作用。

2．3 星形膠質(zhì)細(xì)胞的變化 GFAP染色結(jié)果顯示，正常對(duì)照組大鼠免疫組化染色后可見星形膠質(zhì)細(xì)胞的樹突呈向心排列，細(xì)胞數(shù)較少，胞體不明顯;模型組大鼠在發(fā)病后可見胞體明顯增大，突起增長和增粗，GFAP免疫反應(yīng)明顯增強(qiáng);治療組大鼠與正常對(duì)照組所見基本相同，星形膠質(zhì)細(xì)胞在形態(tài)、數(shù)量和結(jié)構(gòu)上未發(fā)生明顯變化。

正常對(duì)照組及干預(yù)組與模型組的GFAP陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)在大腦(P＜0．05)、腦干(P＜0．01)、脊髓(P＜0．05)中存在明顯差異;而治療組與正常組的GFAP陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)并無明顯差異(P＞0．05)。與正常組相比，模型組的星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量呈明顯上升，而經(jīng)過雄激素作用的治療組，其星形膠質(zhì)細(xì)胞在數(shù)量上與正常組相比并無差異(P＞0．05)。這些結(jié)果表明雄激素對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量的增加及結(jié)構(gòu)形態(tài)的變化都起到了抑制作用(見圖1)。

圖1 各組大鼠大腦、腦干、脊髓中GFAP陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)的變化

3 討論

EAE是人脫髓鞘疾病MS經(jīng)典的動(dòng)物模型。EAE是由嚙齒類或靈長類動(dòng)物的髓鞘素抗原進(jìn)行免疫接種而誘導(dǎo)產(chǎn)生的，目前國內(nèi)外學(xué)者廣泛采取此動(dòng)物模型來研究多發(fā)性硬化，是國際上公認(rèn)的多發(fā)性硬化癥研究的標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物模型。常用于建立EAE模型的動(dòng)物有SJL/J小鼠、B10PL小鼠、Lewis大鼠、豚鼠等，且上述動(dòng)物模型在EAE模型建立中存在雌雄個(gè)體差異［5～7］。本實(shí)驗(yàn)采用我國常見的非敏感系鼠Wistar大鼠，注射以豚鼠全脊髓和完全弗式佐劑自制成的混合乳劑(抗原)來制作多發(fā)性硬化動(dòng)物模型［5］，模型組發(fā)病率為60%，與先前報(bào)道的Wistar大鼠對(duì) EAE 具有一定的抵抗性一致［5，7］。

星形膠質(zhì)細(xì)胞已經(jīng)被證實(shí)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)起著神經(jīng)調(diào)節(jié)、保護(hù)、pH平衡、神經(jīng)發(fā)育過程中的軸突生長控制、內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和血腦屏障維護(hù)等作用。近年來研究認(rèn)為，星形膠質(zhì)細(xì)胞在炎性脫髓鞘疾病髓鞘損傷早期異常活躍，髓鞘脫失后可激發(fā)明顯的星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)［10，11］。星形膠質(zhì)細(xì)胞是具有大量放射狀突起的小圓錐細(xì)胞，直徑為9～10μm，核大，呈圓形或卵圓形，染色質(zhì)稀少，核仁不明顯;胞漿中除含有一般的細(xì)胞器外，尚含有許多由膠質(zhì)絲(glial filament)組成的圓纖維結(jié)構(gòu)，呈交錯(cuò)排列，在突起中的走向與突起縱軸平行。GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞的主要成分，是星形膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)志物［8，9］。星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的病理性損害起應(yīng)答反應(yīng)，EAE模型中的GFAP反應(yīng)明顯增強(qiáng)，反映了星形膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量及功能狀態(tài)同時(shí)受到了影響。星形膠質(zhì)細(xì)胞的變化還反映在其表達(dá)的生長因子、堿性成纖維細(xì)胞因子等因子水平的變化上［10，11］。

性激素是影響星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能的重要因素之一［3，4，12］。雄激素是一類含有 19 個(gè)碳原子的甾體激素，雄激素能促進(jìn)和維持精子發(fā)生、促使雄性性征的出現(xiàn)并維持其正常狀態(tài)、作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、促進(jìn)代謝和生長發(fā)育等功能。雄激素對(duì)不同腦區(qū)正常星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)及生物學(xué)行為，以及星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)GFAP mRNA的水平等都有明顯的調(diào)節(jié)作用［7，13～15］。本實(shí)驗(yàn)研究鏡下可見模型組大鼠在發(fā)病急性期可見胞體明顯增大，突起增長和增粗，GFAP免疫反應(yīng)明顯增強(qiáng)，治療組大鼠與正常對(duì)照組所見基本相同。統(tǒng)計(jì)學(xué)也表明，模型組與治療組GFAP陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．01)，模型組與正常對(duì)照組GFAP陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)差異也是有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．01)，治療組與正常對(duì)照組GFAP陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)。說明在EAE的發(fā)病過程中中樞神經(jīng)GFAP表達(dá)明顯增加，在雄激素的干預(yù)下，治療組中GFAP表達(dá)減少，與正常對(duì)照組無顯著差異。睪丸酮可能通過直接作用于神經(jīng)元的雄激素與雌激素受體而間接實(shí)現(xiàn)其對(duì)星形細(xì)胞的影響。睪丸酮對(duì)星形細(xì)胞的調(diào)節(jié)可能也存在著直接作用途徑。但Chowen等人［14］的研究也發(fā)現(xiàn)，性激素對(duì)正常大鼠星形細(xì)胞的數(shù)量沒有顯著影響，這種不一致的原因尚不清楚，是否與睪丸酮促細(xì)胞分裂、增殖作用存在組織差異性，有待進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用雄激素干預(yù)EAE，可見雄激素治療組HE與髓鞘染色改變沒有模型組明顯;治療組的發(fā)病率低于模型組，潛伏期長于模型組(P＜0．05)，臨床評(píng)分雖然治療組(1．56±0．99)低于模型組(1．87±0．73)，但統(tǒng)計(jì)學(xué)上無顯著差異性，雄激素在改善臨床癥狀的效果不是很明顯，可能與樣本例數(shù)偏少有關(guān)，存在一定的誤差有關(guān)。總之，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雄激素對(duì)EAE在治療上有一定的效果，但關(guān)于EAE及MS存在性別上的差異和雄激素在其中的作用機(jī)制目前仍不清楚［16～18］，隨著進(jìn)一步的研究，將會(huì)有更全面的認(rèn)識(shí)，從而發(fā)現(xiàn)更有效的治療方法。

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