香港遠志黃酮苷對局灶性腦缺血再灌注大鼠血腦屏障的保護及作用機制

詹海濤， 吳劍峰， 李海燕， 孟紅旗， 曾煦欣

超早期溶栓是治療急性腦梗死的有效方法，但缺血再灌注引起的繼發改變，使腦組織損傷進一步加重。再灌注期間血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)破壞導致的腦水腫，是急性腦梗死常見致死原因。如何在發作前給予干預性藥物，使腦組織處于預適應狀態，產生保護作用，對于減緩再灌注損傷具有重要意義。本研究應用線栓法，建立大鼠大腦中動脈阻塞(MCAO)局灶性腦缺血再灌注損傷模型，探討香港遠志黃酮苷預處理，對再灌注后BBB的通透性、腦含水量、基質金屬蛋白酶-9(matrix metallo-proteinase-9，MMP-9)、水通道蛋白 4(aquaporin 4，AQP 4)表達的影響，為臨床應用提供研究依據。

1 材料與方法

1．1 香港遠志黃酮苷的提取、分離與鑒定 香港遠志藥材采自廣東，采用硅膠、Sephadex LH-20、半制備高效液相色譜等色譜技術對香港遠志全株的70%甲醇提取物進行分離純化，綜合運用紅外光譜(IR)、紫外光譜(UV)、質譜(HRESI-MS、ESI-MS)、核磁共振光譜(1H NMR、13C NMR、DEPT、1H-1HCOSY、HMQC、HMBC、NOESY)等波譜學技術，鑒定出兩種黃酮苷單體化合物:山柰酚-3-O-葡萄糖苷(PHN-08)和山柰酚-3-O-蕓香糖苷(PHN-11)。

1．2 動物分組、給藥及缺血再灌注模型制備體重280～300g雄性SD大鼠(廣東省醫學實驗動物中心提供)120只，隨機分5組:假手術組、模型組、PHN-08干預組、PHN-11干預組及合方組，每組24只。將PHN-08、PHN-11制備成2種注射液，分別含PHN-08 12mg/ml及PHN-11 16mg/ml，合方為上述2種組分按單組分含量等比混合。術前1w按4ml/kg/d、生理鹽水稀釋腹腔注射、每天1次給藥，假手術組、模型組按相同方式給等量生理鹽水。采用線栓法［1］建立右側大腦中動脈閉塞(MCAO)模型，模型組及干預組腦缺血1h后拔出線栓，分別行再灌注24h和48h，蘇醒后手術側出現Horner征和對側肢體運動障礙為造模成功，假手術組僅分離血管。將造模中死亡、出血過多、呼吸困難、術后2h不蘇醒的大鼠棄之，取大鼠另造模。每組大鼠室溫下自由進食、進水，分別于再灌注24h和48h測定相關指標。

1．3 相關指標測定 在設定時間點，模型及干預組大鼠隨機分2組(每組6只)，一組快速斷頭處死，取缺血側大腦，冠狀切開，前半部測定腦含水量，后半外側部測定 BBB通透性，內側部測定 AQP 4mRNA;另一組測定MMP-9。假手術組大鼠隨機分2組，術后按上述設定時間點和方法測定相關指標。

1．3．1 BBB 通透性測定 應用 Uyama等［1］方法，以滲出血管壁外單位腦組織伊文氏藍(Evan’s blue，EB)含量評價BBB通透性。大鼠處死前1h，腹腔注射10%的水合氯醛麻醉，用2%EB生理鹽水溶液(4ml/kg)經股靜脈注入，1h后，用生理鹽水自左心室灌注至右心耳流出清亮液體，斷頭取腦，加入2ml 50%三氯醋酸中勻漿，10000r/min，20min，將上清液與無水乙醇3:1稀釋，用熒光分光光度計測熒光值。每份樣品EB濃度由外標準法算出，無水乙醇與50%三氯乙酸按3:1制備校零標準品。不同濃度EB標準樣品由校零標準品配置，由標準曲線計算樣品濃度，測定每份標本EB量與組織質量比，算出單位腦組織EB含量(μg/g)。

1．3．2 腦含水量測定 大鼠快速斷頭取腦，測濕重后，置電烤箱(110℃，24h)后，速測干重。腦含水量(%)=(腦濕重－腦干重)/腦濕重×100。

1．3．3 MMP-9測定 水合氯醛麻醉大鼠，4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液灌注固定，斷頭取腦，4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液固定24h。連續恒冷冰凍切20μm片。每只大鼠隨機選2張切片，依次用PBS(pH 7．4)漂洗，0．3%H2O2孵育 15min，5% 小牛血清白蛋白封閉，置1∶200多克隆兔抗鼠MMP-9抗體孵育(4℃、過夜)。用1∶200生物素化羊抗兔IgG孵育2．5h，1∶200ABC 復合物孵育1h，DAB 呈色，PBS漂洗，脫水封片(陰性對照分別以正常羊血清、兔抗鼠MMP-9多克隆抗體為一抗和二抗)。切片在10×40倍光鏡下，隨機取5個視野，計數每視野陽性細胞數(陽性胞質呈棕黃色，陰性呈綠色)，算出MMP-9陽性細胞均數。

1．3．4 AQP4 mRNA 測定 大鼠快速斷頭取腦，采用 Trizol和RNA PCR Kit(AMV)試劑盒，RTPCR法測定。電泳結果由凝膠圖象分析系統定量，AQP4 mRNA的量化表達，由AQP4與β2actin產物的光密度積分比算出。

1．4 統計學分析 采用SPSS 13．0軟件進行分析，數據以±s表示，兩樣本間比較用t檢驗，多組間比較采用方差分析，P＜0．05差異有統計學意義。

2 結果

2．1 EB含量測定 模型組及干預組再灌注24h及48h的EB含量均較假手術組顯著增多(P＜0．001);干預組再灌注24h及48h的EB含量均顯著低于模型組(其中:合方組再灌注24hP＜0．01，余P＜0．05)，見表1。

2．2 腦含水量測定 與假手術組比較，模型組及干預組再灌注24h及48h的腦含水量均顯著增多(其中:模型組P＜0．001，干預組P＜0．05);干預組再灌注24h及48h的腦含水量均顯著低于模型組(其中:合方組再灌注48hP＜0．01，余P＜0．05)，見表1。

2．3 MMP-9陽性細胞測定 與假手術組比較，模型組及干預組再灌注24h及48h的MMP-9陽性細胞數均顯著增多(P＜0．001)，干預組再灌注24h及48h的MMP-9陽性細胞數均顯著低于模型組(其中:PHN-08、PHN-11組P＜0．05，合方組P＜0．01)，見表2。

2．4 AQP4 mRNA測定 與假手術組比較，模型組及干預組再灌注24h及48h的AQP4 mRNA表達均顯著增高(P＜0．001)，干預組再灌注24h及48h的AQP4 mRNA表達均顯著低于模型組(其中:PHN-11、合方組再灌注24hP＜0．01，余P＜0．05)，見表2。

表1 香港遠志黃酮苷對大鼠腦缺血再灌注24h及48h EB含量、腦含水量影響(±s)

表1 香港遠志黃酮苷對大鼠腦缺血再灌注24h及48h EB含量、腦含水量影響(±s)

與假手術組比較*P ＜0．05，#P ＜0．001;與模型組比較△P ＜0．05;▲P ＜0．01

EB含量(μg/g)腦含水量(%)組別 例數 再灌注24h 再灌注48h 再灌注24h 再灌注48h假手術組模型組PHN-08組PHN-11組合方組6 6 6 6 6 0．58 ±0．13 5．38 ±0．49#4．65 ±0．47#△4．58 ±0．41#△4．25 ±0．39#▲0．54 ±0．12 4．62 ±0．46#4．05 ±0．36#△3．97 ±0．29#△3．94 ±0．27#△78．25 ±2．47 85．97 ±3．03#81．46 ±2．52＊△81．40 ±2．28＊△81．29 ±2．20＊△78．31 ±2．39 87．91 ±3．16#83．18 ±2．91＊△82．92 ±2．64＊△81．37 ±2．18＊▲

表2 香港遠志黃酮苷對大鼠腦缺血再灌注24h及48h MMP-9陽性細胞、AQP4 mRNA影響(±s)

表2 香港遠志黃酮苷對大鼠腦缺血再灌注24h及48h MMP-9陽性細胞、AQP4 mRNA影響(±s)

與假手術組比較#P ＜0．001;與模型組比較△P＜0．05，▲P ＜0．01

MMP－9 AQP4 mRNA(AQP4/β-actin)組別 例數陽性細胞數再灌注24h 再灌注48h 再灌注24h 再灌注48h假手術組模型組PHN-08組PHN-11組合方組6 6 6 6 6 3．71 ±0．58 13．18 ±2．16#10．35 ±1．84#△10．07 ±1．79#△9．71 ±1．63#▲3．68 ±0．53 20．91 ±2．83#17．25 ± 2．39#△17．09 ± 2．14#△16．10 ± 2．20#▲0．82 ±0．03 1．20 ±0．08#1．09 ±0．05#△1．07 ±0．05#▲1．04 ±0．04#▲0．80 ±0．02 1．34 ±0．17#1．14 ±0．13#△1．12 ±0．14#△1．09 ±0．13#△

3 討論

超早期溶栓治療缺血性卒中，快速恢復局部血供，是急性期治療的關鍵，但再灌注損傷易形成腦水腫，導致死亡率和致殘率增高。Fisher等［2］認為通過預防性使用某些藥物可減輕再灌注損傷程度，達到預防性腦保護(prophylactic neuroprotection)作用。但開發療效確切、不良反應小、應用方便的預適應藥物，仍需大量深入的藥物篩選、藥效和作用機制研究，在此領域，植物藥具有獨特的開發應用前景。遠志屬的多種植物在文獻古籍中具有安神益智作用，現代藥理學研究表明其具有提高學習記憶力、腦保護和抗癡呆作用。香港遠志(Polygala hongkongensis)系遠志科(Polygalaceae)遠志屬植物，在民間以全草入藥，具有活血、化瘀、解毒之功效［3］。本研究首次選用香港遠志，觀察其黃酮苷單體化合物PHN-08、PHN-11，對大鼠局灶性腦缺血再灌注24h及48h的BBB通透性、腦含水量、MMP-9及AQP4 mRNA表達的影響，探究其藥理性預適應對BBB的保護與作用機制。

正常的BBB可防止大分子物質擴散入腦實質，維持神經系統內環境穩定，腦缺血再灌注導致其結構和功能損傷，是腦水腫形成的主要原因。因此，保護BBB是防治或減輕缺血性腦水腫的關鍵。研究證實［4，5］，BBB 的通透性改變與再灌注時間密切相關，再灌注3h腦組織的EB滲出量開始增加，提示BBB受損，通透性開始增加，再灌注6～12h，BBB通透性逐漸增加，再灌注24h，通透性增加達到高峰。本研究結果顯示，與假手術組比較，模型組及干預組再灌注24h及48h的腦皮質EB含量和腦含水量均顯著增加，再灌注24h的EB含量增高最顯著，而腦含水量的增加于再灌注48h最顯著，提示，腦缺血再灌注24h已導致BBB通透性增加達到高峰，至再灌注48h形成嚴重的腦水腫。與模型組比較，PHN-08、PHN-11及合方組再灌注24h及48h，腦皮質EB含量和腦含水量均顯著降低，特別是再灌注24h及48h，在BBB通透性及腦含水量增加的高峰期，合方組的效果更顯著，表明香港遠志黃酮苷預處理，可顯著改善局灶性腦缺血再灌注大鼠BBB的通透性，有效減輕繼發性腦水腫，從而顯示出對BBB的保護作用。

腦缺血再灌注損傷的發生機制十分復雜，涉及諸多病理過程，此過程中基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)的高表達受到關注，尤以MMP-9活性表達最為顯著。MMP激活后可水解和破壞細胞外基質(extracellular matrix，ECM)，使BBB受損，通透性增高，導致血管源性腦水腫［6］。研究結果發現［4］，MMP-9的表達在腦缺血再灌注3h開始增加，此后12h、1d、2d、4d 和7d 的表達均顯著增加，其中2d為高峰期，與腦皮質以EB含量為標志的BBB開放時間相關，證實BBB的損傷和MMP-9活性增高有關。本研究結果顯示，與假手術組比較，模型組及干預組再灌注24h及48h的MMP-9表達均顯著增加。與模型組比較，再灌注 24h及 48h，PHN-08、PHN-11及合方組的MMP-9表達均顯著降低，合方組效果更顯著，這提示，香港遠志黃酮苷降低BBB通透性、減輕繼發性腦水腫的作用機制，與抑制MMP-9的表達有關。

水通道蛋白(apuaporins，AQPs)是一組廣泛存在于各種生物細胞膜的通道蛋白，主要介導水分子的跨膜轉運。中樞神經系統以AQP4分布最廣，尤與毛細血管和軟腦膜接觸的膠質細胞表達最顯著，是膠質細胞在腦脊液與血管間介導水分子的跨膜轉運的重要通道蛋白。研究證實［7］AQP4的高表達與缺血誘導的腦水腫密切相關。動物實驗及臨床研究也證實［8］，AQP4阻斷劑可緩解腦水腫的發生和發展。本研究結果顯示，與假手術組比較，模型組及干預組再灌注24h及48h的AQP4表達均顯著增加。與模型組比較，再灌注24h及48h，PHN-08、PHN-11及合方組的MMP-9表達均顯著降低，PHN-11及合方組再灌注24h效果更顯著，這提示，香港遠志黃酮苷通過抑制AQP4的表達，保護BBB的完整性、緩解繼發性腦水腫。

本研究結果表明，香港遠志黃酮苷預處理，在多時段、多靶點對局灶性腦缺血再灌注大鼠BBB具備保護作用，作用機制可能是抑制MMP-9和AQP4的表達，改善BBB通透性，緩解繼發性腦水腫，從而顯示出有效的藥理性預適應效能。本研究香港遠志黃酮苷單一組分與組分配伍間的效果差異，或許因組分配伍后造成藥物特征或藥物作用環境改變而致。新近的體外和在體研究證實［9～11］，香港遠志有效成分具有抗氧化作用，因此，香港遠志黃酮苷改善BBB通透性的更為明確作用機制，有待進一步研究抑制MMP-9、AQP4的表達與抗氧化間的因果關系，療效的時序性以及是否影響其他遞質或分子。

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