慢性低灌注大鼠血清及腦組織中ICAM－1、NF－κBp65、TNF－α及IL－1β的表達

王 敏， 曹秉振

血管性癡呆(vascular dementia，VD)是指由于各種腦血管病引起的腦功能障礙的后天獲得性智能損害綜合征，其確切發病機制目前尚不明確。臨床研究發現VD患者在出現癥狀前2年就存在以額葉、海馬區為中心的諸多腦區彌漫性腦血流量下降［1］，而老年癡呆(Alzheimer’s，AD)患者是在癡呆癥狀出現后才開始出現腦血流量的下降［2］。故腦血流量慢性持續性下降被認為是VD的發病機制之一。腦缺血后炎癥反應誘導腦血管內皮細胞細胞間黏附因子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)、核因子 κB(nuclear factor-κB，NF-κB)、腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)及白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)表達增加，ICAM-1作為內皮細胞與白細胞之間的重要黏附介質，介導了炎性細胞侵入腦缺血區，激活的NF-κB通過調節相關靶基因的轉錄活性，參與炎癥反應、免疫反應、細胞凋亡和自由基損傷等病理生理過程［3］，參與腦缺血損傷的炎癥過程。TNF-α和IL-1-β被認為是缺血過程中最主要的炎癥反應因子，可能是眾多細胞因子的重要啟動因子，在促進腦梗死損傷過程中發揮重要作用。本實驗選用成年雄性Wistar大鼠，采用雙側頸總動脈永久結扎導致前腦慢性低灌注的動物模型，觀察了各組大鼠在缺血后不同時間段的血清及腦組織中ICAM-1、NF-κBp65、TNF-α和IL-1-β的表達，探討炎性細胞因子在慢性低灌注致VD發病機制中的作用。

1 材料和方法

1．1 實驗動物分組 健康Wistar雄性大鼠180只(清潔級，鼠齡4～5個月，體重350～450g，由山東大學齊魯醫院實驗動物中心提供，許可證號:SCXK(魯)2005-0006-0018)。分為正常對照組、假手術對照組和模型組，模型組又分為術后1d、3d、7d、14d、1m、2m、3m、4m 8個小組。采用完全隨機化分組的方法，每組18只大鼠。模型組制作方法:用鹽酸氯胺酮注射液0．2ml/100g腹腔麻醉，分離出雙側頸總動脈并分別結扎動脈的遠近端，從中間剪斷，確保血流被阻斷，術中大鼠肛溫保持在36．5℃ ～37．5℃，手術后動物被送至通風和有空調的動物房飼養，動態觀察其行為變化。正常對照組不做任何處理。假手術對照組除不結扎雙側頸總動脈外，其余處理與模型組相同。

1．2 實驗方法

1．2．1 動物模型評價標準及檢測方法 在術后1d、3d、7d、14d、28d，模型組大鼠每組隨機取10 只，對術后大鼠神經功能恢復的程度進行改良神經功能缺損評分(modified neurological severity scores，mNSS)。在術后1d、3d、7d、14d、1m、2m、3m、4m，模型組大鼠每組隨機取10只，行Morris水迷宮實驗檢測大鼠的學習記憶能力。

1．2．2 標本的采集和固定 在術后1d、3d、7d、14d、1m、2m、3m、4m，每組隨機取10 只大鼠，開胸自心尖處取血2ml，室溫下孵育3h，3000r/min離心15min，分離血清，置－70℃，用于ELISA。10只大鼠中隨機取6只，經升主動脈快速灌注生理鹽水后斷頭取腦，去除嗅球、小腦和低位腦干，一側大腦半球立即置于－70℃冰箱，用于提取RNA;另一側大腦半球置于冰浴中腦組織勻漿，4℃3000r/min離心15min，取上清，置 －70℃，用于ELISA。10只大鼠中取4只，經灌注生理鹽水后用4℃4%多聚甲醛灌注固定，斷頭取腦，置于福爾馬林中固定48h后常規制作石蠟切片。正常對照組和假手術對照組做相同處理。

1．3 組織病理染色 全部切片均行HE、MBP染色。免疫組化染色采用SP法，按照SP試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)說明書進行操作。MBP抗體，日本北海道大學醫學部分子病理室提供，按1∶2稀釋。NF-κBp65抗體，購于NeoMarkers公司，按1∶100稀釋。ICAM-1抗體，TNF-α抗體及IL-1β抗體，武漢博士德生物工程有限公司，按1∶100稀釋。PBS代替一抗作為陰性對照。

1．4 光鏡下觀察 以胞漿或胞核染成棕色或棕黃色的細胞為陽性細胞。不重復隨機選取缺血區海馬10個視野，高倍鏡(10×40)下計數陽性細胞，技術方法采用標準網絡，以“個/視野”為單位，結果用±s表示。

1．5 ELISA 按照TNF-α ELISA試劑盒(晶美生物工程有限公司)說明書操作。

1．6 RT-PCR 將冰凍的大鼠腦組織按照組織RNA提取試劑盒(北京天為時代科技有限公司)提取總RNA，并用無RNase的DNase I處理純化。使用Oligo 6．0軟件設計引物，由北京天為時代科技有限公司合成(見表1)。β-actin為內參照。使用2×Taq PCR MasterMix試劑盒(北京天為時代科技有限公司)加入模板和引物，PCR擴增儀(美國GeneAmp PCR System 2400型)進行擴增。應用2．0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。采用凝膠成像分析儀3UV Transilluminator Model LMS-26E進行灰度掃描。用系統所帶軟件Image TRO Plus進行灰度掃描和定量分析。NF-KBp65 mRNA及ICAM-1 mRNA水平以PCR產物的灰度與β-actin的灰度之比表示。結果用±s表示。

表1 PCR擴增引物序列

2 結果

2．1 組織學觀察

2．1．1 HE、MBP染色 見圖1。正常對照組及假手術對照組神經細胞形態正常。模型組大鼠缺血后1～3d，海馬區錐體細胞缺血水腫呈三角形，核固縮，嗜伊紅，間質稀疏呈空泡樣變，CA1區錐體細胞及齒狀回細胞減少;缺血后1m，除上述表現外，腦室周圍白質疏松，呈空泡樣變，MBP染色可見髓鞘脫失;缺血后3m，可見較多炎性細胞浸潤，主要是單核吞噬細胞，部分炎性細胞圍繞小靜脈周圍形成袖套樣改變;缺血后3m，皮質下白質出現多個軟化灶，白質疏松更加明顯，MBP染色示髓鞘脫失明顯。

2．1．2 免疫組化 見圖2、圖3、表2、表3。正常對照組及假手術對照組大鼠有極少量ICAM-1、NF-κB p65表達。模型組大鼠缺血3d，海馬表達ICAM-1增加達到高峰，皮質及海馬表達NF-κB p65增加;缺血1～7d，皮質及腦室周圍白質TNF-α、IL-1β表達增強，皮質深層、海馬CA1區明顯增加;缺血7～14d，皮質及白質表達ICAM-1、TNF-α、IL-1β 增加，陽性反應明顯增強，胞漿深染，白質及海馬中陽性細胞進行性增多，缺血7d海馬表達NF-κB p65達到高峰;缺血14d后，皮質、海馬ICAM-1、NF-κB p65、TNF-α、IL-1β 表達則減弱，白質愈疏松處陽性細胞大量聚集;缺血2～4m，白質廣泛表達ICAM-1、NF-κB p65、TNF-α、IL-1β，皮質及海馬區表達減少，但陽性細胞數仍高于對照組。

2．2 ELISA測大鼠血清及腦組織勻漿液中TNF-α的含量 見表4。模型組大鼠血清中TNF-α在缺血后7d及1個月出現兩次高表達，缺血后7d最高;除缺血后4個月組與假手術對照組、空白對照組比較P＜0．05，其余組比較P均＜0．01;腦組織勻漿中 TNF-α 在缺血后14d及2個月出現兩次高表達，缺血后14d最高，與假手術對照組、正常對照組比較P均＜0．01。

2．3 RT-PCR測大鼠腦組織勻漿液中ICAM-1、NF-KBp65的含量 見圖4、圖5、表5。經灰度掃描分析，模型組大鼠NF-KBp65mRNA在缺血后3d信號即增加，缺血7d時最高，明顯高于正常對照組和假手術對照組，P＜0．01;隨后逐漸下降，缺血3m時與對照組比較仍P＜0．01。ICAM-1mRNA在缺血后3d表達最高，隨后逐漸下降，缺血3m時再次升高，除缺血1d組與2m組與正常對照組和假手術對照組比較無顯著差異外(P＞0．05)，其余組 P 均 ＜0．01。

圖1 ①缺血7d海馬;②缺血1m海馬;③缺血3m白質;④缺血3m皮質血管周圍炎性袖套;⑤缺血2m白質;⑥缺血4m白質

圖2 ①缺血3d海馬;②缺血14d皮質;③缺血3m白質;④缺血3d海馬;⑤缺血7d白質;⑥缺血4m白質

圖3 ①缺血14d基底節;②缺血1m視束;③缺血2m白質;④缺血7d海馬;⑤缺血1m皮質;⑥缺血3m白質

圖4 大鼠腦組織NF-KBp65 mRNA表達電泳圖

圖5 大鼠腦組織ICAM-1 mRNA表達電泳圖

表2 慢性腦低灌注大鼠海馬TNF-α和IL-1-β免疫組化表達(χ ± s ，n=4)

表3 慢性腦低灌注大鼠海馬ICAM-1和NF-κBp65免疫組化表達(χ ± s ，n=4)

表4 ELISA法測大鼠血清及腦組織勻漿液中TNF-α的含量(±s)

表4 ELISA法測大鼠血清及腦組織勻漿液中TNF-α的含量(±s)

與假手術對照組、空白對照組比較*P＜0．01，與假手術對照組、空白對照組比較#P＜0．05

組別 血清(pg/ml)(n=10) 腦組織(ng/g)(n=6)正常對照組假手術組2vo 1d組2vo 3d組2vo 7d組2vo 14d組2vo1m組2vo2m組2vo3m組2vo4m組22．52 ±3．10 23．37 ±3．16 93．15 ±5．71*110．56 ±6．72*138．45 ±7．94*58．10 ±4．19*69．18 ±5．88*48．36 ±4．79*39．24 ±3．40*32．13 ±2．36#39．32 ±1．8340．13 ±1．92 129．45 ±4．38*187．27 ±6．30*234．44 ±7．89*341．96 ±8．47*204．47 ±4．62*295．53 ±6．03*242．78 ±4．48*196．82 ±3．92*

表5 RT-PCR法測大鼠腦組織ICAM-1 mRNA和NF-κBp65 mRNA 表達(χ ± s ，n=6)

3 討論

實驗結果顯示慢性低灌注動物模型成功。免疫組化、RT-PCR及ELISA的結果顯示炎性細胞因子ICAM-1、NF-κBp65、TNF-α、IL-1β 在慢性低灌注的過程中出現慢性持續性高表達，其釋放可能在慢性缺血致血管性癡呆的過程中起了一定的作用。Otori等［4］發現持久性雙側頸總動脈結扎后2d皮質腦血流量減少了33%～58%，白質和杏仁核的血流量在術后1w也同樣減少;4w后，腦血流量恢復，而枕葉皮質、白質、蒼白球和黑質仍處于低灌注狀態。由此可見此模型造成的腦血流灌注不足的結果是確切的。這種模型導致的記憶障礙與其它的模型相比，具有慢性、持續性的特點，從而也證實了慢性腦灌注不足可導致進行性認知功能障礙，是血管性癡呆發病的主要原因之一。實驗中所觀察到的病理演變過程可分為兩個階段，早期主要發生在對急性缺血缺氧比較敏感的區域，如額顳葉、視束、海馬和尾殼核，這與文獻報道一致［5］。而一個月后，白質的病變則比較突出，表現為進行性髓鞘脫失。大鼠腦新皮質、海馬錐體細胞及紋狀體區神經細胞損傷與學習記憶障礙有關［6］，另外本研究所觀察到的白質的進行性髓鞘脫失可能與慢性低灌注狀態有關，這與人類皮質下動脈硬化導致慢性白質病變的機制可能是一致的。因此慢性前腦缺血大鼠早期出現的缺血敏感區域的神經元的損傷，及后期出現的進行性白質病變可能是出現進行性認知功能障礙的病理基礎。

TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、NF-κB、缺氧、缺血及再灌注等均可刺激ICAM-1表達上調［7］，其機制可能與炎性細胞因子與炎性介質的合成與釋放有關，或由于缺血導致內皮下組織因子暴露從而激活凝血酶有關。在腦缺血/再灌注時，ICAM-1促使中性粒細胞和巨噬細胞更加緊密地黏附于血管壁，還可釋放蛋白水解酶、白三烯、血小板激活因子等造成內皮細胞和基底膜損傷，從而破壞血腦屏障，促進腦水腫，加重缺血半暗帶區的炎癥反應，導致神經元變性、壞死。急性缺血性腦卒中患者血清中可溶性ICAM-1(sICAM-1)水平在發病后2～5d明顯增高［8］。大鼠腦缺血后3h皮質ICAM-1mRNA表達明顯增高，6 ～12h 達到高峰，并持續 3d［9，10］。本實驗免疫組化示缺血3個月時白質中ICAM-1陽性細胞數進行性增多，與RT-PCR的結果將具有一致性。Fenger等［11］研究認為，腦缺血后NF-κB可能激發了細胞因子的調節轉錄過程。腦缺血后激活Toll樣受體4(TLR4)介導的信號轉導途徑，促使NF-κB快速易位進入核內，促進靶基因表達［12］。激活的NF-κB通過促進炎癥基因的轉錄，誘導細胞因子、黏附因子、炎性酶類的表達和氧自由基的形成及鈣超載，參與炎癥反應、免疫反應、細胞凋亡和自由基損傷過程。NF-κB的激活可能是動脈粥樣硬化發生、發展的始動機制之一，其參與腦缺血炎癥過程的具體機制尚未完全明確［13，14］。可以被 NF-κB 上調表達的細胞因子包括 TNF-α、IL-1β、MCP-1、IL-6、IL-8、ICAM-1、VCAM-1、CD11/CD18 等［15，16］。NF-κB 活化可釋放大量氧化活性物質，并產生自由基，加速細胞凋亡進程［17］。Han 等［18］研究發現，NF-κB 的激活可促使一氧化氮合酶(iNOS)產生自由基，使炎癥反應不斷擴大。Nurmi等［19］對大鼠MCAO模型缺血后6h用NF-κB的抑制劑來治療，發現腦梗死體積減小了48%。抑制NF-κB后，炎性因子表達下調，同時腦梗死程度減輕［20］。Bhakar等［21］用重組腺病毒封閉轉基因小鼠皮質神經元中內源性NF-κB活性會導致神經元死亡，而誘導NF-κB的活性可升高抗凋亡蛋白的水平，具有明顯的神經保護作用。腦缺血損傷后NF-κB的激活對腦組織具有保護作用還是損傷作用尚有爭議，關于NF-κB在缺血性腦損傷中的詳細作用機制還需深入探討。

前炎性細胞因子TNF-α、IL-1-β可能是眾多細胞因子的重要啟動因子，可上調其他細胞因子的產生，導致局部炎癥的擴大，加重腦組織的損傷，TNF-α、IL-1-β可以上調ICAM-1及NF-κB的表達［7］。抑制卒中動物模型前炎性細胞因子的表達可使腦梗死體積減小［22］。有研究發現TNF-α轉基因大鼠比正常大鼠表達大量TNF-α，腦損傷也更嚴重，說明TNF-α在促進腦梗死損傷過程中發揮重要作用［23］。有研究觀察到局灶性腦缺血后1h皮質就觀察到TNF-αmRNA的表達，12h達高峰，一直持續到 5d 后［24，25］。還有研究顯示［26］，在腦缺血再灌注0．5h 和1h，TNF-α、IL-1-β 有明顯升高并可持續至24h，這提示炎性細胞因子在繼發性腦損傷中起著非常重要的作用。TNF-α與再灌注中血腦屏障(BBB)通透性的改變密度有關［27］，應用TNF-α抗體可明顯減輕BBB破壞，說明TNF-α是BBB通透性指標的重要炎性介質。IL-1-β是腦缺血早期表達的促炎因子之一，可促使白細胞與內皮細胞粘附，可趨化多形核細胞在炎癥局部沉積并活化，增加興奮性氨基酸、NO、及自由基等神經毒性物質的產生和釋放。IL-1β還可激活小膠質細胞，加重腦損傷。Caso等［28］用MCAO模型發現利用抗IL-1β單克隆抗體可降低腦梗死面積。采用IL-1轉換酶基因缺陷小鼠研究發現，IL-1β對腦缺血誘導的ICAM-1的表達上調起著重要作用［29］。17β-雌二醇能夠抑制IL-1β所介導的腦內皮細胞ICAM-1的表達和NF-kB活性的增高［30］。此外，TNF-α刺激成纖維細胞、膠質細胞和星形細胞表達神經生長因子，有助于缺血區和周圍區神經元存活。另有研究得出IL-1β具有增強神經元抗損傷和促進修復的作用。因此，腦缺血后腦內TNF-α、IL-1β增加可能具有損傷和修復雙重作用。

綜上所述，本實驗研究結果顯示，雙側頸總動脈永久結扎法可成功建立慢性低灌注的動物模型，結合病理學及行為學改變和RT-PCR的檢測，我們推測炎性細胞因子ICAM-1、NF-κBp65的慢性持續性高表達可能在慢性缺血致血管性癡呆病理損傷過程中起了重要的作用。

［1］Rogers RL，Meyer JS，Mortel KF，et al．Decreased cerebral blood flow proceeds multi-infarct dementia，but follows senile dementia of Alzheimer type［J］．Neurology，1986，36:1 －6．

［2］Rogers RL，Meyer JS，Mortel KF，et al．Decreased cerebral blood flow proceeds multi-infarct dementia，but follows senile dementia of Alzheimer type［J］．Neurology，1986，36:1．

［3］Sunn Z，Andersson R．NF-kappa B activation and inhibition:a review［J］．Stroke，2002，18(2):99 －106．

［4］Otori T，Katsumata T，Muramatsu H．Long-term measurement of cerebral blood flow and metabolism in a rat chronic hypoperfusion model［J］．Clin Exp Pharmacol Physiol，2003，30(4):266 －272．

［5］Wakita H，Tomimoto H，Akiguchi I．Axonal damage and demyelination in the white matter after chronic cerebral hypoperfusion in the rat［J］．Brain Res，2002，924(1):63 －70．

［6］Ni JW，Matsumoto K，Li HB，et al．Neuronal damage and decrease of central acetylcholine level following permanent occlusion of bilateral common carotid arteries in rat［J］．Brain Res，1995，673:290．

［7］Li Y，Hirokazu O，Tomoya N，et al．Delayed expressed TNFR1 co-localize with ICAM-1 in astrocytein mice brain after transient focal ischemia［J］．Neurosci Lett，2004，370(1):30 －35．

［8］Tanne D，Haim M，Boyko V，et al．Soluble intercellular adhesion molecule-1 and risk of future ischemic stroke:a nested case-control study from the Bezafibrate Infarction Prevention(BIP)study cohort［J］．Stroke，2002，33:2182－2186．

［9］Vemuganti R，Dempsey RJ，Bowen KK．Inhibition of intercellular adhesion molecule-1 protein expression by antisense oligonucleotides is neuroprotective after transient middle cerebral artery occlusion in rat［J］．Stroke，2004，35:179 －184．

［10］Ding C，He Q，Li PA，et al．Diabetes increases expression of ICAM after a brief period of cerebral ischemia［J］．J Neuroimmunol，2005，161(1 －2):61－67．

［11］Fenger C，Drejdahl N，Wirenfeldt M，et al．Tumor necrosis factor and its p55 and p75 receptors are not required for axonal lesion-induced microgliosis in mouse fascia dentata［J］．Glia，2006，54(6):591 －605．

［12］Boersma MC，Meffert MK．Novel roles for the NF kappaB signaling pathway in regulating neuronal function［J］．Sci Signal，2008，1(6):7．

［13］Zhang W，Potrovita I，Tarabin V，et al．Neuronal activation of NF-kappaB contributes to cell death in cerebral ischemia［J］．J Cereb Blood Flow Metab，2005，25:30 －40．

［14］Gareus R，Kotsaki E，Xanthoulea S，et al．Endothelial cell-specific NF-kappaB inhibition protects mice from atherosclerosis［J］．Cell M etab，2008，8:372 －383．

［15］Vartanian KB，Stenzel-Poore MP．Toll-like receptor tolerance as a mechanism for neuroprotection［J］．Transl Stroke Res，2010，1:50 －59．

［16］Pradillo JM，Romera C，Hurtado O，et al．TNFR1 upregulation mediates tolerance after brain ischemic preconditioning［J］．J Cereb Blood Flow Metab，2005，25(2):193 －203．

［17］Song YS，Lee YS，Narasimhan P，et al．Reduced oxidative stress promotes NF-kappa-B mediated neureprotective gene expression after transient focal cerebral ischemia:lymphocytotrophic cytokines and an tiapoptotie factors［J］．J Cereb Blood Flow Metab，2007，27(4):764 －775．

［18］Han HS，Karabiyikoglu M，Kelly S，et al．Mild hypothermia inhibits nuclear factor-kappa B teanslocation in experimental stroke［J］．J Cerb Blood Flow Metab，2003，23(5):589 －598．

［19］Nurmi A，Vartiainen N，Pihlaja R，et al．Pyrrolidine dithiocarbamate inhibits translocation of nuclear factor kappa-B in neurons and protects against brain ischaemia with a wide therapeutic time window［J］．Neurochem，2004，91(3):755 －765．

［20］Kim JB，Yu YM，Kim SW，et al．Anti-inflammatory mechanism is involved in ethyl pyruvate-mediated efficacious neuroprotection in the postischemic brain［J］．Brain Res，2005，26:188 －192．

［21］Bhakar AL，Tannis LL，Zeindler C，et al．Constitutive nuclear factor-ΚB activity is required for central neuron survival［J］．J Neurosci，2002，22:8466－8475．

［22］Zaremba J，Losy J．Cytokines in clinical and experimental ischemic stroke［J］．Neurol Neurochir Pol，2004，38(Suppl 1):S57 －62．

［23］Pettigrew I C，Kindy MS，Scheff S，et al．Focal cerebral ischemia in the TNF-alpha-transfienic rat［J］．J Neuroinflammation，2008，5(1):47．

［24］WangY，KawamumN，Schmelzer JD，et al．Decreased peripheral nerve damage after ischemia-reperfusion injury in mice lacking TNF-alpha［J］．Neurol Sci，2008，267(1 －2):107 －111．

［25］Haddad M，Rhinn H，Bloquel C，et al．Anti-inflammatory effects of PJ34，a poly(ADP-ribose)polymerase inhibitor，intransient focal cerebral ischemia in mice［J］．Br J Pharmaco1，2006，149(1):23．

［26］Kumar S，Singhal V，Roshan R，et al．Hperine inhibits TNF-alpha induced adhesion of neutrophils to endothelial monolayer through suppression of NF-kappaB and I kappaB kinase activation．［J］．Eur J Pharmacol，2007，575(1 －3):177 －186．

［27］Loos M，Dihne M，Block F，et al．Tumor necrosis factor-alpha expression in areas of remote degeneration following middle cerebral artery occlusion of the rat．［J］．Neuroseience，2003，122(2):373 －380．

［28］Caso JR，Moro MA，Lorenzo P，et al．Involvement of IL-1β in acute stress-induced worsening of cerebral ischaemia in rats［J］．Eur Neuropsychopharmacol，2007，17(9):600．

［29］Huang FP，Wang ZQ，Wu DC，et al．Early NFkappaB activation is inhibited during focal cerebral ischemia in interleukin-1beta-converting enzyme deficient mice［J］．J Neurosci Res，2003，73(5):698 －707．

［30］Galea E，Santizo R，Feinstein DL，et al．Estrogen inhibits NF-kB-dependent inflammation in brain endothelium without interfering with I kappaB degradation［J］．Neuroreport，2002，13:1469 －1472．