慢性丙型肝炎直接抗病毒藥物耐藥研究進(jìn)展

成軍

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院，北京100015)

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染是導(dǎo)致肝硬化、肝細(xì)胞癌以及肝衰竭的重要病因之一，全世界約有1.8億人感染HCV，但僅有50%～60%的患者經(jīng)Peg-IFN聯(lián)合利巴韋林標(biāo)準(zhǔn)治療后可以獲得持續(xù)病毒與應(yīng)答(sustained virological response，SVR)［1］。低應(yīng)答率可能由多種病毒和宿主相關(guān)因素所致，此外干擾素(inter feron，IFN)和利巴韋林的不良反應(yīng)也對(duì)治療劑量以及療程產(chǎn)生一定的影響［2-3］。因此，臨床上迫切需要療效更高且耐受性更佳的藥物。直接抗病毒藥物(direct-acting antiviral，DAA)可特異、靶向抑制HCV復(fù)制，現(xiàn)已成為抗HCV治療的研究熱點(diǎn)。2011年已有2種藥物被美國(guó)FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床，另有多種藥物正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)［4-5］?，F(xiàn)就DAA藥物研發(fā)現(xiàn)狀，耐藥特征及其影響因素做一介紹。

1 DAA藥物研發(fā)現(xiàn)狀

根據(jù)其作用機(jī)制，當(dāng)前DAA藥物主要包括：NS3/ 4A蛋白酶抑制劑、NS5A抑制劑、NS5B RNA依賴性RNA聚合酶抑制劑，此外還有一些間接抑制HCV復(fù)制或目前機(jī)制尚未明確的藥物。當(dāng)前各種DAA藥物的研發(fā)現(xiàn)狀表1。其中，Boceprevir和 Telaprevir于2011年5月先后被美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于治療慢性丙型肝炎［4-5］。

2 DAA藥物的耐藥特征

與乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)、艾滋病病毒(human immunodeficiency virus，HIV)耐藥相似，HCV對(duì)于DAA藥物的耐藥也可分為基因型耐藥與表型耐藥。其中表型耐藥是指通過(guò)體外HCV復(fù)制系統(tǒng)證實(shí)，HCV序列上某個(gè)位點(diǎn)的變異可以導(dǎo)致HCV對(duì)于某種藥物的敏感性下降，通常采用IC50/EC50的改變來(lái)衡量;此外體外復(fù)制系統(tǒng)還可用于評(píng)價(jià)變異本身對(duì)病毒復(fù)制能力的影響。而基因型耐藥是指通過(guò)分子生物學(xué)方法發(fā)現(xiàn)HCV序列上存在表型耐藥分析證實(shí)的可導(dǎo)致藥物敏感性下降的變異。由于現(xiàn)階段DAA藥物中除Boceprevir與Telaprevir之外均處于臨床Ⅰ、Ⅱ期研究，因此目前關(guān)于這些藥物耐藥位點(diǎn)的數(shù)據(jù)大多來(lái)源于體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。

在DAA藥物基因型耐藥檢測(cè)中，直接測(cè)序法是當(dāng)前最常應(yīng)用的方法，它可進(jìn)一步區(qū)分為PCR產(chǎn)物直接測(cè)序和克隆測(cè)序。只有當(dāng)變異株在病毒群中所占比率大于約25%時(shí)，PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法方可檢出。而對(duì)于克隆測(cè)序而言，如果每份標(biāo)本提取超過(guò)80份克隆，則可檢出占病毒群比率約5%的變異株。除此以外，還包括雜交分析法、限制性酶切法以及深度測(cè)序法等其他檢測(cè)方法。

表1 抗HCV DAA藥物研發(fā)現(xiàn)狀Tab.1 DAAs in development for HCV infection

2.1 NS3/4A蛋白酶抑制劑

Telaprevir是一種高抗病毒活性但相對(duì)低耐藥屏障的藥物，體外研究［6］共發(fā)現(xiàn)以下耐藥相關(guān)位點(diǎn)，包括V36、T54、R155和A156，它們可單獨(dú)或聯(lián)合出現(xiàn)。V36、T54、R155變異可導(dǎo)致低度或中度耐藥，而A156V/T可導(dǎo)致高度耐藥。病毒的變異是藥物壓力選擇的結(jié)果，在選擇壓力持續(xù)存在的情況下，變異株可在病毒群中保持一定比率;但當(dāng)藥物選擇壓力解除后，變異株能否維持其在病毒群中的比率與其本身的復(fù)制能力等多種因素有關(guān)。就Telaprevir耐藥變異而言，停藥隨訪7～10 d，變異株在病毒群中所占比率顯著下降。經(jīng)過(guò)3～7個(gè)月的隨訪，絕大部分變異株被野生株取代［6］。

Boceprevir是一種中度抗病毒活性、相對(duì)較低耐藥基因屏障的藥物，其耐藥相關(guān)變異位點(diǎn)有V36、T54、R109、R155、A156以及V170［7］。體外實(shí)驗(yàn)［8］證實(shí)，這些位點(diǎn)變異可導(dǎo)致Boceprevir低度或中度耐藥。Boceprevir與Telaprevir存在交叉耐藥位點(diǎn)，但相同的變異位點(diǎn)導(dǎo)致2種藥物耐藥的程度可存在差異。Boceprevir停藥時(shí)存在耐藥變異的患者，隨訪1年甚至4年后，采用克隆測(cè)序分析法仍可檢出相關(guān)耐藥變異［9］。

其他NS3/4A蛋白酶抑制劑大多處在Ⅰ、Ⅱ期臨床研究階段，體外實(shí)驗(yàn)也相繼提出了這些藥物的耐藥位點(diǎn)，不同藥物之間耐藥位點(diǎn)存在差異?？偟膩?lái)說(shuō)，R155位點(diǎn)是這類藥物主要的交叉耐藥位點(diǎn)［5］。

2.2 聚合酶抑制劑

HCV聚合酶抑制劑可分為核苷類與非核苷類2種。NM283與R1626是之前研究的兩種核苷類HCV聚合酶抑制劑。體外實(shí)驗(yàn)［10］表明這2種藥物的耐藥相關(guān)位點(diǎn)分別位于S282T與S96T。遺憾的是，這2種藥物的臨床試驗(yàn)均因不良事件而終止。R7128是目前正在進(jìn)行Ⅱ期臨床研究的核苷類聚合酶抑制劑，體外研究［10］表明，上述NM283和 R1626耐藥相關(guān)的S282T與S96T變異均不會(huì)導(dǎo)致R7128耐藥。

目前在NS5B聚合酶表面至少發(fā)現(xiàn)了4個(gè)不同的非核苷類聚合酶抑制劑作用位點(diǎn)，相應(yīng)的藥物分別命名為NNI-site1抑制劑、NNI-site2抑制劑、NNI-site3抑制劑以及 NNI-site4抑制劑。NNI-site1抑制劑BI207127具有低到中度抗病毒活性。V494I/A、I424V以及P496A位點(diǎn)變異可導(dǎo)致NNI-site1抑制劑BILB1941敏感性下降。在NNI-site2抑制劑中，F(xiàn)ilibuvir正在進(jìn)行I期臨床研究，研究［5］發(fā)現(xiàn)M423位點(diǎn)變異可能與患者對(duì) Filibuvir的敏感性下降相關(guān)。ANA598屬于NNI-site3抑制劑，該藥物臨床試驗(yàn)未見(jiàn)病毒學(xué)突破，但體外實(shí)驗(yàn)鑒定出多個(gè)該藥物可能的耐藥位點(diǎn)。NNI-site4抑制劑ABT-333的體外研究證實(shí)，C316Y以及Y448C變異可導(dǎo)致該藥物耐藥，此外臨床研究發(fā)現(xiàn)S556G與病毒學(xué)突破相關(guān)。

2.3 NS5A抑制劑

BMS-790052能夠與NS5A蛋白第一結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合，從而有效抑制HCV，但目前尚無(wú)關(guān)于該藥物耐藥的研究［11］報(bào)道。

3 影響HCV對(duì)DAA耐藥的因素

3.1 HCV的異質(zhì)性

HCV具有較高的轉(zhuǎn)換率，其半衰期為2～5 h。在HCV感染個(gè)體中，平均每天產(chǎn)生1010～1012個(gè)病毒顆粒。而HCV的RNA依賴性RNA聚合酶保真性較差，且缺乏校正活性，其每個(gè)基因組中的每個(gè)核苷酸位點(diǎn)出現(xiàn)錯(cuò)配的概率為10－3～10－5［12］。因此在HCV感染患者體內(nèi)存在大量的異質(zhì)性序列，即準(zhǔn)種。在患者體內(nèi)的準(zhǔn)種中，何種毒株占優(yōu)勢(shì)取決于不同毒株的復(fù)制能力以及各種已知與未知的病毒與宿主因素。一般而言，患者體內(nèi)的毒株以野生株為主。根據(jù)HCV序列的差異，目前 HCV至少可分為6種基因型(31% ～33%)與超過(guò)100種亞型(20% ～25%)［13］。因此考慮到HCV不同基因型以及亞型之間的序列異質(zhì)性，理論上直接作用于病毒本身的DAA藥物對(duì)不同基因型和亞型病毒的作用可能存在差異。這一點(diǎn)在Telaprevir針對(duì)不同基因(亞)型患者進(jìn)行的臨床試驗(yàn)中得到了證實(shí)［14］。

3.2 DAA藥物的耐藥屏障

DAA藥物的耐藥屏障由多種因素決定，包括：HCV基因型與亞型、抗病毒活性與藥代動(dòng)力學(xué)、患者依從性以及抗病毒藥物與HCV相關(guān)位點(diǎn)的結(jié)合力，此外藥物耐藥所需要的變異位點(diǎn)的數(shù)目以及藥物與結(jié)合位點(diǎn)之間的結(jié)合方式也發(fā)揮一定的作用。依據(jù)既往的臨床試驗(yàn)結(jié)果，非核苷類藥物的耐藥屏障最低，其次為NS3蛋白酶抑制劑，而核苷類藥物的耐藥屏障最高［5］。

3.3 藥代動(dòng)力學(xué)與治療依從性

目前大部分DAA藥物為口服給藥。已獲準(zhǔn)上市的Boceprevir與Telaprevir的半衰期均較短，需每日3次給藥。從藥物臨床試驗(yàn)來(lái)看，在Telaprevir的Ⅰ期臨床試驗(yàn)中1 250 mg每日2次給藥的10例患者中有6例發(fā)生病毒學(xué)突破與耐藥變異;而在750 mg每日3次給藥的8例患者中僅有1例發(fā)生耐藥變異［15］。此外，每日給藥次數(shù)與藥物的不良反應(yīng)還會(huì)影響治療依從性，從而對(duì)耐藥的發(fā)生起到重要的作用。

3.4 聯(lián)合治療與DAA耐藥

從HIV與HBV的抗病毒治療經(jīng)驗(yàn)中得知，聯(lián)合治療有助于延長(zhǎng)耐藥發(fā)生所需要的時(shí)間，并增加病毒長(zhǎng)期受抑制的概率。DAA藥物聯(lián)合Peg-IFN和利巴韋林的臨床試驗(yàn)表明，聯(lián)合治療可減少耐藥造成的不良影響并獲得療效疊加/協(xié)同的效果。如Telaprevir與Peg-IFN和/或利巴韋林聯(lián)合治療的Ⅱ期臨床試驗(yàn)［16］表明，三聯(lián)治療可導(dǎo)致HCV RNA載量持續(xù)下降，且無(wú)病毒學(xué)突破發(fā)生;與標(biāo)準(zhǔn)治療相比，聯(lián)合治療可更顯著地抑制HCV RNA。目前關(guān)于DAA藥物的聯(lián)合治療仍在探索之中，治療療程以及最終獲得SVR的情況尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。

［1］ Zeuzem S，Berg T，Moeller B，et al.Expert opinion on the treatment of patients with chronic hepatitis C［J］.J Viral Hepat，2009，16(2)：75-90.

［2］ Wohnsland A，Hofmann W P，Sarrazin C.Viral determinants of resistance to treatment in patients with hepatitis C［J］.Clin Microbiol Rev，2007，20(1)：23-38.

［3］ Ge D，F(xiàn)ellay J，Thompson A J，et al.Genetic variation in IL28B predicts hepatitis C treatment-induced viral clearance［J］.Nature，2009，461(7262)：399-401.

［4］ Asselah T，Marcellin P.New direct-acting antivirals’combination for the treatment of chronic hepatitis C［J］.Liver Int，2011，Suppl 1：68-77.

［5］ Sarrazin C，Zeuzem S.Resistance to direct antiviral agents in patients with hepatitis C virus infection［J］.Gastroenterology，2010，138(2)：447-462.

［6］ Sarrazin C，Kieffer T L，Bartels D，et al.Dynamic hepatitis C virus genotypic and phenotypic changes in patients treated with the protease inhibitor telaprevir［J］.Gastroenterology，2007，132(5)：1767-1777.

［7］ Bartels D J，Zhou Y，Zhang E Z，et al.Natural prevalence of hepatitis C virus variants with decreased sensitivity to NS3.4A protease inhibitors in treatment-naive subjects［J］.J Infect Dis，2008，198(6)：800-807.

［8］ Pawlotsky J M.Treatment failure and resistance with directacting antiviral drugs against hepatitis C virus［J］.Hepatology，2011，53(5)：1742-1751.

［9］ Susser S，F(xiàn)orestier N，Welker M W，et al.Detection of resistant variants in the hepatitis c virus ns3 protease gene by clonal sequencing at long-term follow-up in patients treated with boceprevir［J］.J Hepatol，2009，50：S7.

［10］Ali S，Leveque V，Le Pogam S，et al.Selected replicon variants with low-level in vitro resistance to the hepatitis C virus NS5B polymerase inhibitor PSI-6130 lack cross-resistance with R1479［J］.Antimicrob Agents Chemother，2008，52(12)：4356-4369.

［11］Tellinghuisen T L，Marcotrigiano J，Rice C M.Structure of the zinc-binding domain of an essential component of the hepatitis C virus replicase［J］.Nature，2005，435(7040)：374-379.

［12］Neumann A U，Lam N P，Dahari H，et al.Hepatitis C viral dynamics in vivo and the antiviral efficacy of interferonalpha therapy［J］.Science，1998，282(5386)：103-107.

［13］Simmonds P，Bukh J，Combet C，et al.Consensus proposals for a unified system of nomenclature of hepatitis C virus genotypes［J］.Hepatology，2005，42(4)：962-973.

［14］Foster G R，Hezode C，Bronowicki J P，et al.Activity of telaprevir alone or in combination with peginterferon alfa-2a and ribavirin in treatment-naive genotype 2 and 3 hepatitis-C patients：interim results of study C209［J］.J Hepatol，2009，50：S22.

［15］Reesink H W，Zeuzem S，Weegink C J，et al.Rapid decline of viral RNA in hepatitis C patients treated with VX-950：a phase Ib，placebo-controlled，randomized study［J］.Gastroenterology，2006，131(4)：997-1002.

［16］Hezode C，F(xiàn)orestier N，Dusheiko G，et al.Telaprevir and peginterferon with or without ribavirin for chronic HCV infection［J］.N Engl J Med，2009，360(18)：1839-1850.