正交試驗(yàn)優(yōu)選秦皮中總酚的超聲輔助提取工藝

白建華，姚宇霞，武宇芳，趙二勞(忻州師范學(xué)院化學(xué)系，山西忻州034000)

植物多酚是一類含有酚羥基結(jié)構(gòu)的化合物，是植物體內(nèi)最重要的次生代謝產(chǎn)物，具有獨(dú)特的生理和藥理活性，在抗腫瘤、抗病毒以及延緩組織和人體衰老等方面都具有良好的作用［1-2］。植物多酚已成為生物化學(xué)、天然產(chǎn)物化學(xué)、醫(yī)藥、食品及日用化妝品等領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一，倍受關(guān)注［3］。

秦皮為木犀科植物白蠟樹Fraxinus chinensis Roxb.、苦櫪白蠟樹Fraxinus rhynchophylla Hance、尖葉白蠟樹Fraxinus szaboana Lingelsh或宿柱白蠟樹Fraxinus stylosa Lingelsh的樹干皮或枝干皮，主產(chǎn)于陜西、河南、河北、遼寧、吉林等地，為傳統(tǒng)常用中藥，收載于《中國藥典》2010年版一部［4］。秦皮具有清熱解毒、清肝明目之功效，常用于熱痢、泄瀉、赤白帶下、目赤腫痛、目生翳膜等癥［5］。研究表明，秦皮中富含秦皮甲素、秦皮乙素等香豆素類、酚類及皂類等活性成分［6］，目前對秦皮中香豆素類成分研究較多［7-9］，秦皮中多酚類成分的研究鮮見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用單因素結(jié)合正交試驗(yàn)的方法，探求秦皮中總酚的最佳超聲提取工藝，以期為秦皮中多酚類物質(zhì)的提取和秦皮資源的合理利用提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器752N紫外可見分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，KQ-400KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，HH-2型電熱恒溫水浴鍋(北京科偉永興儀器有限公司)，AL104電子分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)。

1.2 試藥秦皮購于當(dāng)?shù)乇静萏茫?jīng)李滿秀教授鑒定為白蠟樹正品。藥材粉碎機(jī)粉碎，過60目篩，裝瓶備用。沒食子酸，分析純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;酚試劑，生化試劑，上海海聚生物科技有限公司;碳酸鈉、乙醇等試劑均分析純。實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 秦皮中總酚提取率的測定以沒食子酸作對照品，采用Folin-Ciocalteu法測定［3，10］。

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精確稱取沒食子酸對照品0.011 5 g，用水溶解并定容于100 mL量瓶中，制成質(zhì)量濃度為0.115 mg/mL的沒食子酸對照品溶液。精密吸取沒食子酸對照品溶液0.0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL，分別置于10 mL比色管中，都加入5.0 mL水、0.5 mL Folin-Ciocalteu試劑，1 min后加入1.5 mL質(zhì)量濃度為75.0 mg/mL的Na2CO3溶液，用水定容至刻度，搖勻，75℃水浴反應(yīng)10 min。在波長760 nm處測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，沒食子酸質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)作圖繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程A=0.093 3C+0.004，r=0.999 3。在4.6～16.1 μg/mL范圍內(nèi)沒食子酸溶液與其吸光度值呈良好的線性關(guān)系。

2.1.2 秦皮總酚提取率的測定直接吸取或適當(dāng)稀釋后吸取秦皮提取液1.0 mL，置于10 mL比色管中，按2.1.1項(xiàng)下操作測定吸光度。由標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算秦皮提取液中總酚濃度，按下式計(jì)算秦皮中總酚提取率:

總酚提取率(%)=［總酚提取量(mg)/秦皮質(zhì)量(mg)］×100%

2.2 秦皮總酚超聲波輔助提取工藝篩選

2.2.1 秦皮中總酚的提取取秦皮樣品約5 g，精密稱定，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，加入一定量的乙醇溶液，浸泡5 min后，進(jìn)行超聲波輔助提取，提取液濾過后，定容待測。

2.2.2 單因素試驗(yàn)參考相關(guān)文獻(xiàn)［11］，為方便實(shí)際應(yīng)用，同時考慮到溫度過高影響多酚的穩(wěn)定性，會造成部分多酚分解，研究了常溫下，含乙醇量(20%、30%、40%、50%、60%、70%和80%)、超聲波功率(80、160、240、320、400 W)、超聲時間(20、30、40、50、60 min)、料液比(g∶mL)(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40和1∶50)對秦皮總酚超聲輔助提取效果的影響。都進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，提取液濾過后定容，按2.1.2項(xiàng)方法測定，計(jì)算秦皮總酚提取率。

2.2.3 正交試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以含乙醇量、超聲波功率、超聲時間和料液比為因素，進(jìn)行常溫下超聲波提取秦皮中多酚的正交試驗(yàn)，優(yōu)選最佳提取工藝，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 因素水平

3 結(jié)果與討論

3.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 含乙醇量對秦皮總酚提取率的影響超聲功率320 W，料液比(g∶mL)1∶30、超聲提取時間40 min，改變含乙醇量，研究含乙醇量對秦皮總酚提取率的影響，結(jié)果見圖1。可見隨著含乙醇量的增加，秦皮總酚提取率增高，但當(dāng)含乙醇量超過60%時，總酚提取率反而有所下降，實(shí)驗(yàn)選擇含乙醇量為60%。

圖1 含乙醇量對總酚提取率的影響

3.1.2 超聲功率對秦皮總酚提取率的影響含乙醇量為60%，料液比(g∶mL)1∶30、超聲提取時間40 min，改變超聲功率，研究超聲功率對秦皮總酚提取率的影響，結(jié)果見圖2。可見秦皮提取率隨超聲功率的增大而增大，但超聲功率超過320 W后提取率卻下降，其原因可能是由于超聲功率過高，會導(dǎo)致總酚降解和其他雜質(zhì)溶出增加所致。故實(shí)驗(yàn)選擇超聲功率320 W。

圖2 超聲功率對總酚提取率的影響

3.1.3 超聲提取時間對秦皮總酚提取率的影響含乙醇量為60%，料液比(g∶mL)1∶30、超聲功率320 W，改變超聲提取時間，研究超聲提取時間對秦皮總酚提取率的影響，結(jié)果見圖3。隨著提取時間的增加，總酚提取率增大，但40 min后再延長提取時間提取率變化不大，實(shí)驗(yàn)選擇超聲提取時間為40 min。

圖3 超聲時間對總酚提取率的影響

3.1.4 料液比對秦皮總酚提取率的影響含乙醇量為60%，超聲功率320 W，超聲提取時間40 min，改變料液比，研究料液比對秦皮總酚提取率的影響，結(jié)果見圖4。可見秦皮總酚提取率隨料液比增加而增加，但料液比(g∶mL)超過1∶40后提取率基本不變，過低的料液比不利于秦皮總酚的溶出，料液比過高會增大成本，實(shí)驗(yàn)選擇料液比(g∶mL)為1∶40。3.2正交試驗(yàn)結(jié)果及分析按照2.2.3項(xiàng)的正交試驗(yàn)方案試驗(yàn)，優(yōu)選秦皮中總酚的超聲輔助提取工藝，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

圖4 料液比對總酚提取率的影響

表2 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2可以看出，影響超聲輔助提取秦皮中總酚的因素大小順序?yàn)樘崛r間＞含乙醇量＞料液比＞超聲功率，提取時間和含乙醇量對總酚提取率影響較大，超聲功率對總酚提取率的影響最小。在考察范圍內(nèi)，秦皮總酚超聲輔助提取最佳工藝條件確定為:A2B2C3D2，即超聲功率320 W，超聲提取時間40 min，料液比(g∶mL)1∶50，含乙醇量為60%。3.3

驗(yàn)證試驗(yàn)為了進(jìn)一步考察優(yōu)選工藝的可靠性和穩(wěn)定性，精密稱取5 g秦皮，在上述確定的工藝條件下進(jìn)行3次平行提取試驗(yàn)，測得總酚提取率分別為5.28%、5.34%和5.27%，平均為5.30%，RSD為0.72%。試驗(yàn)表明，此工藝穩(wěn)定、重復(fù)性好。

3.4 超聲輔助提取法與加熱回流提取法工藝比較精密稱取5 g秦皮樣品3份，進(jìn)行加熱浸提，與超聲輔助提取法比較，結(jié)果見表3。

表3 兩種提取方法比較

由表3可見，在其他條件相同時，超聲輔助提取法與加熱浸提法相比，秦皮總酚的提取率提高了約10%，提取時間縮短了三分之一，表明超聲輔助提取法具有提取時間短，提取率高等優(yōu)點(diǎn)。

4 結(jié)論

通過單因素結(jié)合正交試驗(yàn)的方法，優(yōu)選的超聲輔助提取秦皮中總酚的最佳工藝條件為60%乙醇，超聲功率320 W，超聲提取時間40 min，料液比(g∶mL)1∶50。此工藝條件下，秦皮中總酚提取率可達(dá)5.30%。與加熱浸提法相比，超聲提取具有操作簡便、節(jié)能高效等優(yōu)點(diǎn)。

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