響應面法優化女貞子有效成分的提取工藝

常星潔， 劉漢清， 鄒建榮， 劉志輝， 王 寧， 賈 媛， 嚴 冬*

(1.南京中醫藥大學，江蘇南京 210046;2.南京藥業股份有限公司，江蘇南京 210004;3.南京中醫藥大學一附院，江蘇南京 210036)

女貞子為木犀科女貞屬植物女貞Ligustrum lucidumAit的成熟果實，具有滋補肝腎、明目烏發之功效，用于肝腎陰虛、頭昏目眩、耳鳴、腰膝疲軟、須發早白等癥。女貞子有效成分之一齊墩果酸為脂溶性極強的三萜類成分，國內外對其化學性質和藥理作用進行了深入而系統的研究［1］。而女貞子作為傳統補益藥，一般采取水煎法服用，其水溶性有效成分亦不容忽視。研究表明，女貞子中的環烯醚萜類成分具有保肝利膽、抗肝纖維化、抗菌消炎、抗腫瘤、降血脂、降血糖、降低血液黏度、增強機體免疫調節等多種藥理活性［2-3］。本研究以環烯醚萜類成分中含有量較高的特女貞苷和三萜類成分齊墩果酸為考察指標，進行女貞子回流提取工藝的研究，并在單因素試驗基礎上采用Box-Behnken響應面法，研究各因素對女貞子有效成分得率的影響。

1 儀器與試劑

Agilent 1100高效液相色譜儀:G1322A脫氣機，G1311A四元泵，G1316A柱溫箱，G1314A VWD檢測器(美國Agilent公司);電子分析天平(BP-211D型，德國賽多利斯公司);DP-S24型電熱恒溫水浴鍋(上海精弘實驗設備有限公司)。

女貞子飲片購自江蘇省醫藥公司，經江蘇省中醫院主任中藥師周琴妹鑒定為女貞子酒制品。齊墩果酸對照品(購自中國藥品生物制品檢定所，定量測定用，批號:0709-9803)，特女貞苷對照品(購自南京澤郎醫藥科技有限公司，定量測定用，批號:ZL20100928TNZG)。測定用甲醇和乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法和結果

2.1 特女貞苷定量測定方法

2.1.1 色譜條件［4］Hedera C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流動相為甲醇-水(40∶60);柱溫30 ℃;體積流量為1.0 mL/min;檢測波長224 nm，進樣量5 μL。HPLC 圖譜見圖1。

圖1 特女貞苷對照品(A)和女貞子供試品(B)色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of specnuezhenide control and Ligustri lucidi Fructus 1.特女貞苷 1.specnuezhenide

2.1.2 標準曲線的繪制 精密稱取特女貞苷10.26 mg于25 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，配制成質量濃度為406.4 μg/mL的對照品貯備液。精密量取該貯備液一定量，甲醇稀釋成質量濃度為40.64、81.28、121.92、203.20、243.84、325.12 μg/mL 的一系列對照品溶液，按2.1.1項下色譜條件進行測定，以峰面積積分值為縱坐標、樣品質量濃度為橫坐標繪制標準曲線。結果表明，特女貞苷在40.64～325.12 μg/mL與峰面積呈良好的線性關系，回歸方程為:Y=6.292 4X+3.585 9，r=0.999 5。

2.1.3 供試品溶液制備與測定 精密吸取女貞子提取液2 mL至10 mL量瓶中，甲醇定容，搖勻，0.45 μm濾膜濾過后，即得。分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各5 μL注入高效液相色譜儀，測定，計算。

2.2 齊墩果酸定量測定方法

2.2.1 色譜條件［5-6］sunfire C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動相為乙腈-水(90∶10);柱溫30℃;體積流量0.8 mL/min;檢測波長 215 nm。HPLC圖譜見圖2。

2.2.2 標準曲線的繪制 精密稱取齊墩果酸對照品10.45 mg于25 mL量瓶中，甲醇定容，配制成質量濃度為418.0 μg/mL對照品貯備液。取該貯備液一定量，加甲醇稀釋成質量濃度為8.36、16.72、41.80、83.60、104.50 μg/mL 的一系列對照品溶液，按2.2.1項下色譜條件進行測定，以峰面積積分值為縱坐標、樣品質量濃度為橫坐標繪制標準曲線。，8.36～104.50 g/mL面積呈良好的線性關系，回歸方程為:Y=4.568 7X-1.063 5，r=0.999 8。

圖2 齊墩果酸對照品(A)和女貞子供試品(B)色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of oleanolic acid control and Ligustri lucidi Fructus 1.齊墩果酸 1.oleanolic acid

2.2.3 供試品溶液制備與測定 精密吸取女貞子提取液2 mL至10 mL量瓶中，甲醇定容，搖勻，0.45 μm濾膜濾過后得供試品溶液。分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μL注入高效液相色譜儀，測定，計算。

2.3 提取因素和相關水平的選擇

2.3.1 乙醇質量分數范圍的選擇 取壓扁女貞子20 g，分別以水、30%、50%、70%、95%乙醇為溶劑，10倍量回流提取兩次，每次1 h。合并提取液，按定量測定方法制備供試品，測定特女貞苷、齊墩果酸，結果如圖3(n=3)。

圖3 不同乙醇質量分數對女貞子有效成分提取量的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on yield of constituents in Ligustri lucidi Fructus

如圖所示，以水為溶劑，齊墩果酸質量分數極低，提取液中幾乎無法檢出;以95%乙醇為溶劑，雖然齊墩果酸質量分數最高，但特女貞苷質量分數反而下降;而以50%、70%乙醇為溶劑對2個指標值均能達到較好的提取效果，所以選擇乙醇質量分數的下限為50%，上限為70%。

2.3.2 提取時間范圍的選擇 取壓扁女貞子20 g，以10倍量60%乙醇提取2次，時間分別為0.5、1、1.5、2 h，合并提取液，按定量測定方法制備供試品，測定特女貞苷、齊墩果酸，結果如圖4(n=3)。可知提取1 h后，二者質量分數變化不大，考慮到多因素交互作用的影響，提取時間范圍定為0.5～1.5 h。

圖4 不同提取時間對女貞子有效成分提取效果的影響Fig.4 Effect of extracting time on yield of constituents in Ligustri lucidi Fructus

圖5 不同料液比對女貞子有效成分提取效果的影響Fig.5 Effect of ratio of solid to liquid on yield of constituents in Ligustri lucidi Fructus

2.3.3 溶劑倍量范圍的選擇 取壓扁女貞子20 g，分別加入4倍量、7倍量、10倍量、14倍量60%乙醇提取2次，每次1 h，合并提取液，按定量測定方法制備供試品，測定特女貞苷、齊墩果酸，結果如圖5(n=3)，可知10倍溶劑時提取量較高，大于10倍增加不顯著。考慮到生產成本，溶劑倍量范圍定為8～12倍。

2.4 響應面試驗［7-9］

2.4.1 試驗設計和結果 根據Box-Benhnken的中心組合實驗設計原理，綜合單因素試驗結果，選取乙醇質量分數(X1)、溶劑倍量(X2)和提取時間(X3)為自變量，每個自變量的低、中、高實驗水平分別以-1、0、1進行編碼(表1)，實驗方案及結果見表2。提取次數定為2次。

表1 Box-Behnken試驗設計因素與水平的編碼Tab.1 Factor-levels and coding for Box-Behnken design

表2 Box-Behnken試驗設計與結果Tab.2 Arrangement and results of Box-Behnken design

2.4.2 模型擬合 將所得數據用Design-Expert7.1.5軟件進行響應面試驗分析，以綜合評分為響應值Y分別對各因素X(自變量)進行多元線性回歸和二項式方程擬合，回歸方程為:Y=0.86+0.086X1+ 0.038X2+ 0.16X3+ 0.05X1X2-0.021X1X3+5.834E-003X2X3-0.08X12R2=0.984 4，Adj-R2=0.964 3。方差分析結果見表3。

由方差分析結果可知，本試驗選擇區域范圍內，乙醇質量分數和提取時間對特女貞苷和齊墩果酸含，有量有極顯著影響，溶劑倍量、乙醇質量分數和溶劑倍量的交互作用對其有顯著影響。回歸方程失擬檢驗不顯著，表明未知因素對試驗結果干擾很小。擬合檢驗極顯著，表明該方程與實際情況擬合很好，較好地反映了特女貞苷和齊墩果酸質量分數與乙醇質量分數、溶劑倍量和提取時間的關系，所得回歸方程能較好的預測女貞子有效成分隨各參數的變化規律。由回歸模型進行預測分析，綜合評分最大預測值為1.04，最優條件為67.2%乙醇、溶劑量12倍、提取時間1.5 h。

表3 女貞子提取工藝條件響應面擬合回歸方程的方差分析結果Tab.3 Analysis of variance with regression model on extraction conditions of constituents in Ligustri lucidi Fructus with RSM

2.4.3 工藝驗證試驗 根據響應面法優選出的工藝條件，提取女貞子3份(每份100 g)，進行工藝驗證。結果見表4。二項式擬合方程預測值與實測值的偏差率=(1.04-0.95)/1.04×100%=8.7%，說明二項式擬合效果良好，可信度高。特女貞苷和齊墩果酸的轉移率分別達到96.96%和97.3%(轉移率=提取液中特女貞苷或齊墩果酸質量分數/飲片中特女貞苷或齊墩果酸質量分數×100%)，說明優選出的工藝提取效率高。

表4 工藝驗證試驗(n=3)Tab.4 Results of verification test(n=3)

3 討論

女貞子內果皮質地堅硬，有效成分不易溶出，比較了飲片、壓扁整粒和10目粉末提取液中特女貞苷和齊墩果酸質量分數，飲片中特女貞苷和齊墩果酸轉移率只能達到25.14%和23.60%。壓扁后內果皮破裂，有效成分幾乎可以提取完全，轉移率和10目粉末無顯著差異。

曾嘗試用梯度洗脫同時測定特女貞苷和齊墩果酸，但梯度洗脫下齊墩果酸未能與其同分異構體熊果酸分開。故采取一次提取分2次進樣的方法，峰形好，分離度達到要求，操作也較為方便。

女貞子的提取工藝多以齊墩果酸為評價指標，而以特女貞苷和齊墩果酸為綜合指標對女貞子提取工藝的研究尚未見報道。本實驗采用Box-Behnken響應面法，通過非線性模型擬合得出最優提取條件，避免了傳統的正交設計和均勻設計優化法的不足，具有實驗精度高、模型預測性好的優點。

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