效應面法優化對甲氧基肉桂酸乙酯的包合工藝

劉雪梅，李繼英，蘇霞

(廣西中醫學院藥學院，廣西南寧530001)

沙姜是姜科植物山柰Kaempferia galanga L.的干燥根莖，溫中化濕，行氣止痛，主治胃寒疼痛、牙痛、風濕關節痛、跌打損傷，藥用價值較高［1］。沙姜也是一味常用的壯藥(壯藥名為Sagieng)，用于治療咳嗽和肺病、促進傷口愈合，壯族人民早已使用它并積累了豐富的臨床經驗［2］。除藥用外，還大量用作副食和調味劑。

據報道，山柰揮發油抑制胃癌細胞增殖，誘導腫瘤細胞凋亡，對化療藥物有協同增效作用;而揮發油中的肉桂酸酯類化合物，尤其是主要成分-反式和順式的對甲氧基肉桂酸乙酯(MEC)有抗促癌活性［3-6］。由于植物藥遺傳毒性低，因此對甲氧基肉桂酸乙酯有較強的抗腫瘤利用價值，值得進一步深入研究。但是對甲氧基肉桂酸乙酯不溶于水，嚴重影響了它的生物利用度［7-8］。而β-環糊精不僅能提高藥物的溶解度，還能改善藥物的生物利用度和穩定性。

國內常用均勻設計或正交設計進行工藝優化和處方篩選，但這兩種方法精度不夠，預測性不佳，國外很少采用。星點設計和效應面優化法是國外藥學工作者常用的實驗設計和優化方法，優選條件預測性好;近年來國內時有該法用于藥學研究的報道［9-13］。本實驗采用飽和水溶液法制備對甲氧基肉桂酸乙酯-β-CD包合物，星點設計-效應面法優化其最佳的制備工藝，為方便對甲氧基肉桂酸乙酯的臨床應用提供基礎研究。

1 儀器和材料

85-2恒溫磁力攪拌器(武漢精華科研儀器公司);Nexus470傅立葉紅外拉曼光譜儀(美國Nicolet公司);AE100電子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司);GC—14A氣相色譜儀(日本島津公司);FW 24A型壓片機(天津光學儀器廠);Agilent 8453紫外可見分光光度計(美國安捷倫公司);CAMAG REPROSTAR 3薄層色譜儀(瑞士卡瑪公司)。

對甲氧基肉桂酸乙酯(武漢合中化工有限公司，批號:20070802，純度≥99.0%);對甲基肉桂酸乙酯(批號:0835-9601，購自中國藥品生物制品檢定所);β-CD(廣東省郁南順中食品貿易有限公司);其余試劑為分析純，色譜純。

2 方法和結果

2.1 對甲氧基肉桂酸乙酯-β-CD包合物的制備［14］

經過預實驗篩選，采用飽和水溶液法制備。在一定溫度下，稱取一定量的β-CD溶于水中，加熱溶解，制成飽和溶液;同時稱取一定量的對甲氧基肉桂酸乙酯溶于95%乙醇中。待β-CD飽和溶液稍冷后，用恒壓分液漏斗將對甲氧基肉桂酸乙酯乙醇溶液緩慢滴入飽和溶液中，恒溫40℃攪拌。繼續攪拌一定時間后，停止加熱，繼續攪拌，降至室溫，靜置，冷藏24 h，得沉淀，抽濾，洗滌，45℃干燥，稱質量，得白色粉末狀的對甲氧基肉桂酸乙酯包合物。

2.2 包合率和包合物產率測定氣相色譜法測定包合物中對甲氧基肉桂酸乙酯［15］。

2.2.1 色譜條件SE-30石英毛細管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)。柱溫200℃，進樣口溫度與檢測器溫度為250℃，載氣為氮氣。

2.2.2 定量測定

2.2.2.1 樣品溶液制備精密稱取對甲氧基肉桂酸乙酯對照品適量，加入甲醇超聲30 min，完全溶解后加甲醇至刻度，搖勻，制成質量濃度為1.0 mg/mL的對照品溶液。精密稱取適量包合物置量瓶中，加適量甲醇超聲處理，溶解后加至刻度，搖勻制成供試液。

2.2.2.2 標準曲線的制備精密量取對甲氧基肉桂酸乙酯對照品溶液分別配成質量濃度為1.0、0.5、0.25、0.125、0.075 mg/mL的對照品溶液。精密吸取上述對照品溶液各4 μL進樣，按上述色譜條件測定峰面積。以各質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為Y=6×106x－205 745，r=0.999 5，表明對甲氧基肉桂酸乙酯在0.3～4 μg/μL范圍內具有良好的線性關系。對該方法進行精密度試驗、重復性試驗、24 h穩定性測定、加樣回收試驗，得到對甲氧基肉桂酸乙酯的RSD分別為1.95%、1.36%、2.65%，回收率為101.65%。(n=5)

氣相色譜法測定供試液的對甲氧基肉桂酸乙酯，每批3次，計算包合率和包合物產率。

包合率和包合產率的計算公式如下:

2.3 包合物的鑒定

2.3.1 紅外光譜法分別測定對甲氧基肉桂酸乙酯-β-CD物理混合物、對甲氧基肉桂酸乙酯-β-CD包合物、對甲氧基肉桂酸乙酯的溴化鉀壓片、β-CD的溴化鉀壓片在室溫下進行紅外光譜，掃描范圍為500～4 000 cm－1。結果見圖1。由圖可知，物理混合物的IR呈現出藥物和β-CD的疊加峰型特征。其—OH峰位(3 385.73 cm－1)與藥物的—OH峰位(3 387.48 cm－1)一致，C峰位(1 631.29 cm－1)和藥物的CO峰位(1 630.10 cm－1)一致，C—H峰位(2 924.92 cm－1)與β-CD的C—H峰位(2 925.86 cm－1)一致;而包合物的IR與物理混合物明顯不同，某些特征峰向高波數位移，強度大為減弱，如CO峰位升高(由1 630.10升至1 643.32 cm－1);某些特征峰向低波數位移，強度大為減弱，如—OH峰位降低(從3 387.48降至3 373.62 cm－1)，而包合物與β-CD的IR很相似，如C—H峰位(2 930.25 cm－1)與β-CD的C—H峰位(2 925.86 cm－1)相近，表明了藥物與β-CD產生了包合作用;但二者仍存在明顯差異。

2.3.2 薄層色譜法分別精密稱取適量對甲氧基肉桂酸乙酯、對甲氧基肉桂酸乙酯-β-CD包合物，用無水乙醇定容至2 mL;精密稱取包合物適量，加入石油醚，振蕩，洗滌，自然揮干醚液，用無水乙醇定容。各取10 μL點于同一硅膠G薄層板，以石油醚(60～90℃)-三氯甲烷-乙酸乙酯(10∶0.5∶1.5)為展開劑展開，取出晾干，紫外儀366 nm下檢視;再以5%磷鉬酸溶液顯色，105℃烘干。結果顯示366 nm下可見對甲氧基肉桂酸乙酯醇溶液、對甲氧基肉桂酸乙酯-β-CD包合物醇液Rf值基本一致，而對甲氧基肉桂酸乙酯-β-CD包合物醚洗溶液相應位置無斑點，表明對甲氧基肉桂酸乙酯-β-CD包合物已形成，見圖2。

2.3.3 紫外分光光度法精密稱取適量對甲氧基肉桂酸乙酯原藥、β-CD、對甲氧基肉桂酸乙酯+β-CD、對甲氧基肉桂酸乙酯-β-CD包合物(含有對甲氧基肉桂酸乙酯量相當于原藥質量)，5 mL無水乙醇溶解后加入蒸餾水定容至100 mL，以溶劑為空白溶液，于紫外分光光度計中在200～400 nm波長范圍內掃描。結果對甲氧基肉桂酸乙酯在210、225、309 nm處有最大吸收，β-CD和溶劑在λmax處無吸收干擾。包合物與原藥的吸收圖譜基本相同，只是吸收強度稍減，表明包合物形成過程為一物理包合過程，未與β-CD發生化學反應，包合物基本形成。紫外吸收光譜見圖3。

圖1 β-環糊精(a)、對甲氧基肉桂酸乙酯(MEC)(b)、物理混合物(c)、包合物(d)的紅外圖譜Fig.1 IR spectra of β-CD(a)，MEC(b)，β-CD+MEC mixtures(c)and inclusion complexes(d)

圖2 對甲氧基肉桂酸乙酯、對甲氧基肉桂酸乙酯-β-CD包合物薄層色譜圖Fig.2 TLC chromatogram of MEC and inclusion complex

2.4 星點實驗設計經過預實驗考察，確定用藥比例(X1)、包合溫度(X2)和包合時間(X3)為星點設計實驗考察的影響因素，其水平范圍為:用藥比例為10%～20%，包合溫度為30～50℃，包合時間為30～150 min。以對甲氧基肉桂酸乙酯的包合率和包合物產率為考察指標。其中，包合率為工藝篩選的主要指標;在β-CD和對甲氧基肉桂酸乙酯投料量一定的情況下，包合物產率為次要指標。采用三因素五水平星點設計安排實驗，實驗設計和結果見表1、表2。

圖3 對甲氧基肉桂酸乙酯(a)、β-CD(b)、物理混合物(c)、包合物(d)的此外吸收光譜Fig.3 UV absorption spectrum of MEC(a)，β-CD(b)，MEC+β-CD mixtures(c)and MEC-β-CD inclusion complexes(d)

2.5 數據處理與結果分析將表2中對甲氧基肉桂酸乙酯的包合率和包合物產率的數值標準化為0～1間的歸一值，通過數學轉換得到總評歸一值(總評OD值)。以用藥比例、包合溫度和包合時間為自變量，以各總評歸一值對自變量進行多元線性回歸和二次多項式擬合，以復相關系數(r)和P＜0.05為模型判定標準，Statistica 6.0軟件繪制效應面確定對甲氧基肉桂酸乙酯-β-CD包合物的最佳工藝。結果如下:

表1 星點設計因素和水平Tab.1 Factors and levels of central composite design

表2 星點設計實驗和結果(n=3)Tab.2 Result of central composite design(n=3)

多元線性擬合方程:y(OD)=－0.799 1+0.004 2X1+0.026 8X2+0.001 9X3，r=0.644 4，F(3，11)=2.603 4，P=0.104 7＞0.05，表明線性擬合不佳，不宜用線性模型。

二項式擬合方程:y(OD)=－12.744 6+0.663 8X1+0.332 2X2+0.032 0X3－0.000 6X1X2+0.000 6×10－2X1X3－0.000 1X2X3－0.021 2X21+0.003 6X22－0.000 2X23，r=0.839 2，相對于線性擬合有大幅提高，但有多項系數值的P值＞0.05，應對方程刪項簡化，提高其可信度。本實驗以該方程作為分析及模型的預測，故未將模型進一步簡化。

由于效應面圖只能表達含2個自變量的函數，故本實驗固定其中1個自變量為中值，另外2個影響因素為自變量，總評OD值為因變量，以擬合的二項式方程為數學模型，繪制效應面圖，并從效應面上選取最佳的實驗條件。見圖4～6。

圖4 用藥比例和包合溫度及其相互作用對總評OD值的影響(包合時間90 min)Fig.4 Correlative effects of proportion of MEC and inclusion temperature(with time of 90min)

圖5 用藥比例和包合時間及其相互作用對總評OD值的影響(包合溫度40℃)Fig.5 Correlative effects of proportion of MEC and inclusion time(with temperature of 40℃)

圖6 包合溫度和包合時間及其相互作用對總評OD值的影響(用藥比例15%)Fig.6 Correlative effects of inclusion temperature and time(with 15%proportion of MEC)

由圖4～6可知，總評OD值隨著用藥比例、包合時間和包合溫度的增加，先增加后降低。結合包合物制備的實際情況，確定對甲氧基肉桂酸乙酯-β-CD包合物的較佳工藝為:用藥比例為15%，溫度為45℃，時間為90 min。經過3次驗證實驗，實際測得OD平均值為0.972 2，與模型方程理論預測值(0.994 8)的偏差為－2.26%，表明本工藝二項式擬合效果良好，可信度高。

3 討論

本實驗經過預實驗篩選，選用飽和水溶液法制備包合物，操作簡便，適于工業化生產;采用星點設計-效應面法優選包合物的制備工藝，預測性好，為下一步研制對甲氧基肉桂酸乙酯包合物的新劑型奠定了基礎。

鑒于前期實驗條件和時間的限制，本實驗后期將進行對甲氧基肉桂酸乙酯-β-CD包合物的溶解性變化、體外釋放度和穩定性試驗，為優化對甲氧基肉桂酸乙酯包合物工藝設計提供定量的科學依據。

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