原代培養小鼠睪丸間質細胞的甘草毒性研究

孫新明，楊亞軍

(井岡山大學醫學院，江西吉安343000)

不孕不育癥是全球性復雜的醫學和社會學問題之一。隨著工業的日益發達及對環境污染控制的相對不足和臨床藥物濫用，男性因素所引發的不育不孕癥發生率越來越高而逐漸引起人們的重視［1-3］;長期以來，甘草等植物中草藥及其復方常作為中藥材食品添加物及臨床常用藥得以廣泛應用。但近代藥理研究發現，不少臨床常用的中藥如甘草、補骨脂等可促進雌性動物乳腺發育和子宮明顯增質量及血清雌激素水平升高［4］，但其雌激素樣作用是否與環境雌激素一樣具有男性生殖毒性作用?特別是甘草對男性生殖系統的毒性作用目前尚未見細胞毒性研究。鑒于此，本研究從甘草對雄性小鼠睪丸間質細胞體外培養及其分泌睪酮的影響入手研究甘草對睪丸的生殖毒性，為甘草等具有雌激素樣作用中藥材的臨床應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和材料清潔級BABL/c雄鼠10只(購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司);市售藥用甘草采用超聲提取法和樹脂吸附技術自制成浸膏(含甘草提取物62.5 mg/mL)后用PBS溶液配制成10 mg/mL藥物濃度，過濾除菌，置冰箱冷藏備用;

1.2 主要試劑DMEM、DMEM/F12、小牛血清、苔盼藍購于GIBCO公司;膠原酶、透明質酸酶、perooll分離液、Hepes購于SIGMA公司;胰蛋白酶購于AMRESCO公司;HE染色液、PBS、D-hanks液培養基均為自制試劑;其他常規普通試劑均為國產分析純。

1.3 甘草對睪丸間質細胞的體外毒性實驗

1.3.1 小鼠睪丸間質細胞的分離與培養取4～5周齡22～25 g的BABL/c雄鼠10只，按照邵冰玉等報道的方法［5］分離得到睪丸間質細胞懸液。調整細胞密度(3～5×105個/mL)接種于24孔培養板，在10%小牛血清的DMEM培養基中于培養箱(37℃、5%CO2、飽和濕度)中進行培養，每24 h換液。

1.3.2 小鼠睪丸間質細胞體外藥物毒性實驗培養貼壁(記為0)后進行以下分組實驗:一組為不給藥對照組，另一組為給藥實驗組。對實驗組先用MTT法［6］確定甘草提取物對睪丸間質細胞體外毒性的IC50值和最低毒性劑量，以細胞存活率為80%±的藥物濃度為細胞最低毒性劑量;細胞存活率%=(加藥細胞OD-本地OD/對照細胞OD－本地OD)×100%(本底OD值為酶標儀在570 nm波長處檢測無細胞的完全培養基加MTT的光密度值);以IC50值和最低毒性劑量作為高、低兩個劑量藥物濃度，加入0.5 mL藥液于培養的0.5 mL細胞培養液中繼續進行培養。在細胞繼續培養的0、12、24 h、48 h對各組培養貼壁細胞進行H-E染色后光鏡觀察。

1.3.3 睪丸間質細胞培養液中睪酮水平的測定用酶聯免疫吸附法，按照試劑盒使用說明測定1.3.2項中各試驗組在細胞繼續培養的0、12、24、48 h時培養液中睪酮水平。

2 結果

2.1 睪丸間質細胞體外毒性實驗結果

2.1.1 MTT法測定甘草提取物對睪丸間質細胞的毒性結果

結果見表1。

表1 MTT法測定甘草提取物對睪丸間質細胞的毒性結果

MTT法測定結果顯示，甘草提取物對睪丸間質細胞的體外毒性IC50=275 μg/mL，最低毒性劑量為10 μg/mL，即給藥組的高、低劑量質量濃度分別為275 μg/mL和10 μg/mL。

2.1.2 甘草提取物對間質細胞體外培養結果對分離到的睪丸間質細胞培養6 h后細胞開始發生極化，偶有貼壁。培養48 h后(0 h)多數細胞貼壁，對進一步培養的各組細胞進行H-E染色后鏡檢發現，剛貼壁的細胞形態呈梭形或不規則三角形，細胞間以其突起形成網絡狀連接，輪廓不清(見圖1)。隨著培養時間延長，在對照組細胞輪廓成為多角形或不規則形狀，有3～4個突起伸出，至進一步培養48 h后間質細胞呈多邊形或長梭形，貼壁細胞數量逐漸增多而變得越來越密集，但細胞界限越清晰，細胞間有空隙且排列無極性(圖2C～4C);在給藥實驗組，則隨著體外培養時間的延長，細胞的生長狀態變差，貼壁細胞形態變化與對照組相同，但與對照組形成鮮明對比的是，細胞的密度變得越來越稀疏，表明細胞生長分裂受到抑制，有些貼壁細胞發生凋亡，在給藥培養48 h顯得尤為明顯，這種變化在高濃度給藥實驗組比低濃度給藥實驗組更為突出(見圖2～4)。

圖1 培養48 h貼壁的睪丸間質細胞，H-E×200

圖2 對照組培養貼壁的睪丸間質細胞繼續培養12 h(2C)、24 h(3C)和48 h(4C)后細胞形態學觀察，H-E×200

圖3 高濃度給藥組培養貼壁的睪丸間質細胞繼續培養12 h(2H)、24 h(3H)和48 h(4H)后細胞形態學觀察，H-E×200

圖4 低濃度給藥組培養貼壁的睪丸間質細胞繼續培養12 h(2L)、24 h(3L)和48 h(4L)后細胞形態學觀察，H-E×200

2.1.3 培養液中睪酮水平檢測結果用酶聯免疫吸附試劑盒測定培養液中睪酮水平，結果見圖5。統計結果顯示，貼壁細胞繼續培養12 h、24 h及48 h后培養液中睪酮水平，在對照組、低劑量組和高劑量組間兩兩比較差異均極為顯著(P＜0.01)。

圖5 在各藥物濃度下培養間質細胞時培養液中睪酮水平

3 討論

關于植物雌激素對雄性動物的影響有較多研究報道認為，給雄性動物喂飼含異黃酮類雌激素的植物可促進睪丸增重和血清睪酮含量，并促進睪丸曲細精管明顯增大，初級精母細胞形成提前，即具有促進雄性動物生殖系統發育的作用［7］，因而表現出與環境雌激素對雄性個體完全不一樣的作用［8］。但植物雌激素對睪丸細胞體外培養的影響和中草藥雌激素樣作用對睪丸毒性的研究報道并不多。朱鋒榮等［9］的研究認為，植物雌激素(染料木素)在低濃度下(0.1 μmol/L)給藥時可顯著促進睪丸間質細胞分泌睪酮，但當植物雌激素濃度大于5 μmol/L時，卻顯著抑制間質細胞的睪酮分泌。有研究認為，苦參可使精子瞬間失活的最低有效質量濃度為0.85～3.15 g/L，形態學觀察發現苦參堿對精子有致死作用，而蘆薈對雄性鼠性腺、精液有一定的影響，使雌性小鼠的妊娠率降低，畸胎率升高［10］。

甘草具有補脾益氣、清熱解毒、緩急、止痛等功效。常用于脾胃虛弱、倦怠乏力、心悸短、咳嗽痰多、脘脹、四肢攣急、疼痛、癰腫瘡、緩解藥物毒性等。中醫界自古有“十方九草”之說［11］。因此，甘草常作為中藥材食品添加物及臨床常用藥物得以廣泛應用，其主要化學成分是甘草甜素、甘草次酸。中藥藥理學認為，大劑量的甘草甜素有雌激素樣作用，而甘草次酸具有抑制雄性小鼠生殖腺產生睪酮的作用［12］，但其是否與其他含異黃酮類雌激素的植物對男性生殖系統具有類似的作用?目前未見詳細研究報道。

睪丸間質細胞也稱為Leydig細胞，是合成和分泌雄激素(睪酮)的主要場所，其分泌的雄激素可結合支持細胞分泌的雄激素結合蛋白而維持生精小管內較高的雄激素濃度，以促進生精小管內各級生精細胞的增殖、發育，因此睪丸間質細胞與支持細胞和生殖細胞之間關系密切，其生存狀態及分泌睪酮的功能活動可在很大程度上影響、甚或體現睪丸的生殖活動［13］。因此，睪丸間質細胞也通常作為研究藥物對睪丸分泌睪酮作用的體外模型［14］。但睪丸間質細胞的分離純化一直是國際上進行深入研究的瓶頸。本研究應用邵冰玉等［5］的方法分離純化小鼠睪丸間質細胞，因為他們應用17-α羥化酶mRNA擴增表明培養的間質細胞具有較高純度。此外，本研究中對分離到的間質細胞進一步培養后HE染色鏡檢，形態變化與劉玉志等［15］報道的相同，因此在本實驗中未對相同方法分離培養的間質細胞進行進一步鑒定。另外，本研究選用4～5周齡成年小鼠，此時睪丸中間質細胞的數量和分泌能力均達到高峰［16］，便于研究藥物對間質細胞分泌睪酮的影響。本研究結果顯示，超過10 μg/mL甘草提取物濃度對體外原代培養小鼠睪丸間質細胞的生長和睪酮分泌均具有顯著抑制作用，且隨藥物濃度增加和培養時間延長，抑制作用越加明顯。需要提及的是，本研究用的自制甘草浸膏所含的甘草提取物中除了具有對雄性生殖細胞具有影響的甘草甜素、甘草次酸等藥效成分外，還含有多種非療效成分。本研究采用超聲提取法和樹脂吸附技術將藥用甘草自制成浸膏，浸膏中無甘草成分以外的其他對細胞有害的成分，也沒有將甘草中的其他非療效成分去除，結果雖然不能完全反應僅為甘草中甘草甜素或甘草次酸對雄性的毒性作用，這是本研究存在的一個缺陷。但我們認為，這樣制成的甘草浸膏更能反應甘草對男性生殖的毒性。欲知非療效成分對睪丸間質細胞的毒性，可能還需進一步分離甘草中非療效化合物對睪丸細胞毒性進行追蹤研究。但可以肯定的是，在進行細胞體外研究時，甘草浸膏的最低毒性劑量僅為10 μg/mL，而甘草中主要化學成分是甘草甜素和甘草次酸，故其受試物中療效成分的含有量已較低，非療效成分含有量更低，因而也不會對雄性生殖細胞產生很大的毒性。

然而，僅憑在細胞培養系統中添加藥物所表現出的對睪丸間質細胞和生精細胞的生長抑制作用很難斷定該藥物對在體睪丸具有生殖毒性作用，要確切了解甘草對睪丸的生殖毒性作用，需要進一步研究甘草對在體睪丸的毒性作用。

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