地膚子抗真菌化學成分研究

徐云輝，黃浩，郭兆霞，張念，孔德云，華茉莉

(上海醫(yī)藥工業(yè)研究院創(chuàng)新藥物與制藥工藝國家重點實驗室，上海200040)

中藥地膚子為藜科植物地膚Kochia scoparia(L.)Schard的成熟果實，具有清熱利濕、祛風止癢之功效，用于小便澀痛、陰癢帶下、風疹、濕疹、皮膚瘙癢等癥［1］，臨床多以復方入藥［2-5］?，F(xiàn)代一些藥理實驗顯示其水煎劑及醇提物對一些皮膚真菌具有一定的抑制作用［6-7］。目前，對地膚子的生物活性物質(zhì)基礎研究相對較少，其抗真菌活性成分也并未見有明確報道。本研究采用超臨界萃取與系統(tǒng)溶劑法，制備地膚子的不同提取部位樣品，體外紙片擴散法藥敏實驗顯示其正丁醇提取部位對白色念珠菌具有明顯的抑菌活性。由此采用多種色譜分離方法對地膚子的正丁醇提取部位開展了化學成分研究，分離得到8個化合物，依據(jù)其理化性質(zhì)及波譜數(shù)據(jù)分別鑒定為β-谷甾醇(1)，β-胡蘿卜苷(2)，槲皮素(3)，金絲桃苷(4)，3-O-［β-D-吡喃木糖(1→3)β-D-吡喃葡萄糖醛酸］齊墩果酸(也稱地膚子皂苷ⅠC)(5)，異鼠李素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(6)，3-O-［β-D-吡喃木糖(1→3)β-D-吡喃葡萄糖醛酸］齊墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(也稱地膚子皂苷ⅡC)(7)，3-O-［β-D-吡喃葡萄糖(1→2)β-D-吡喃木糖(1→3)β-D-吡喃葡萄糖醛酸］齊墩果酸(8)，其中化合物3、4、6均為首次從該植物中分離得到。體外抗真菌活性測試顯示，化合物8對白色念珠菌有一定抑制作用。

1 儀器和材料

MSD—Trap—XCT，Q—Tof micro(ESI-MS)型質(zhì)譜儀(Agilent公司);DRX—500核磁共振儀(Bruker公司);WFH—203三用紫外分析儀(上海精科實業(yè)有限公司);Waters高效液相色譜儀(2487檢測器，1525二元泵);硅膠H(煙臺芝罘黃務硅膠開發(fā)試驗廠);Sephadex LH-20凝膠(安發(fā)瑪西亞);ODS—A反相硅膠填料(日本YMC公司);Rf200中低壓制備色譜(環(huán)球)。

地膚子購于上海雷允上中藥飲片廠，批號2009100238，經(jīng)上海醫(yī)藥工業(yè)研究院吳彤研究員鑒定為藜科植物地膚的果實。

白色念珠菌為上海醫(yī)藥工業(yè)研究院微生物部門保藏菌種。

2 提取分離

干燥地膚子藥材4 kg，粉碎，經(jīng)CO2超臨界萃取除去油脂，藥渣以80%乙醇回流提取3次，提取液濃縮，所得浸膏采用硅藻土拌樣(1∶1)，石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇依次洗脫，所得甲醇部位再以水飽和正丁醇萃取得正丁醇部位。正丁醇部位(100 g)經(jīng)硅膠柱層析以二氯甲烷-甲醇梯度洗脫，其95∶1洗脫部位經(jīng)再次硅膠柱層析(石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫)得化合物1(30.3 mg);其15∶1洗脫部位經(jīng)乙醇重結晶得化合物2(35.5 mg)，其結晶母液部分經(jīng)LH-20凝膠柱層析得化合物3(8.4 mg);其8∶1洗脫部位經(jīng)再次硅膠柱層析、LH-20凝膠柱層析得化合物5(45.5 mg)，HPLC(甲醇-水系統(tǒng))精制得化合物6(10.0 mg);其6∶1洗脫部位經(jīng)再次硅膠柱層析、LH-20凝膠柱層析得化合物4(9.3 mg);其1∶1洗脫部位經(jīng)再次硅膠柱層析、LH-20凝膠柱層析、中低壓反相硅膠柱層析(甲醇-水梯度洗脫)得化合物7(84.5 mg)、化合物8(102.5 mg)。

3 結構鑒定

化合物1:白色針晶(甲醇)，mp 140～141℃，Liebermann-Burchard反應呈陽性。經(jīng)與β-谷甾醇對照品共薄層，在3種溶劑系統(tǒng)下展開Rf值均一致，混合后測定熔點不下降，故鑒定該化合物為β-谷甾醇。

化合物2:白色粉末，mp 275～277℃，難溶于水、甲醇、三氯甲烷;Libermann-Burchard反應和Molish反應均呈陽性，經(jīng)與胡蘿卜苷對照品共薄層，在3種溶劑系統(tǒng)下展開Rf值一致，混合后測定熔點不下降，故鑒定該化合物為β-胡蘿卜苷。

化合物3:黃綠色粉末，ESI-MS m/z:301［MH］－，325［M+Na］+，分子式C15H10O7。1H-NMR(MeOH-d4，500 MHz)δ:7.62(1H，s，H-2')，7.52(1H，d，J=8.0 Hz，H-6')，6.77(1H，d，J=8.0 Hz，H-5')，6.27(1H，s，H-8)，6.07(1H，s，H-6)。13C-NMR(MeOH-d4，500 MHz)δ:177.5(C-4)，165.7(C-7)，162.7(C-5)，158.4(C-9)，148.9(C-4')，148.1(C-2)，146.4(C-3')，137.4(C-3)，124.3(C-1')，121.8(C-6')，116.3(C-5')，116.1(C-2')，104.6(C-10)，99.4(C-6)，94.5(C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻［8］對照一致，鑒定為槲皮素。

化合物4:黃綠色粉末，Molish反應呈陽性，ESI-MS m/z:463［M-H］－，487［M+Na］+，301［M-162-1］－，分子式C21H20O12。1H-NMR(DMSO-d6，500 MHz)δ:7.60(2H，s，H-2'，H-6')，6.81(1H，d，J=8.5 Hz，H-5')，6.38(1H，s，H-8)，6.17(1H，s，H-6)，5.33(1H，d，J=7.5 Hz，H-1')。13C-NMR(DMSO-d6，500 MHz)δ:178.3(C-4)，164.9(C-7)，161.9(C-5)，157.2(C-9)，157.2(C-2)，149.0(C-4')，145.2(C-3')，134.4(C-3)，122.5(C-1')，122.0(C-6')，116.7(C-5')，115.7(C-2')，104.7(C-10)，103.0(C-1″)，99.2(C-6)，94.1(C-8)，76.5(C-5″)，73.9(C-3″)，72.0(C-2″)，68.7(C-4″)，60.9(C-6″)。以上數(shù)據(jù)與文獻［9］對照一致，鑒定化合物為金絲桃苷。

化合物5:白色粉末，ESI-MS m/z:787［M+Na］+，763［M-H］－，碎片峰631［M-132-1］－，分子式C41H64O13。1H-NMR(C5D5N，500 MHz)δ:0.82，1.00，1.00，1.00，1.04，1.32，1.36(each 3H，s，7×CH3)，3.32(H-3)，4.92(1H，H-1 of Glc)，5.28(1H，H-1 of Xyl)，5.50(H-12)。13CNMR(C5D5N，500 MHz)δ:39.1(C-1)，56.3(C-5)，19.0(C-6)，48.5(C-9)，47.2(C-17)，47.0(C-19)，42.7(C-14)，42.5(C-18)，40.3(C-8)，40.0(C-4)，37.5(C-10)，34.8(C-21)，33.8(C-7)，33.0(C-22)，31.3(C-20)，26.7(C-2)，28.6(C-15)，28.8(C-23)，27.1(C-27)，24.3(C-30)，24.3(C-11)，24.3(C-16)，16.0(C-25)，17.5(C-24)，18.0(C-26)，89.7(C-3)，123.6(C-12)，145.4(C-13)，180.2(C-28)，Glc 107.0(C-1)，75.0(C-2)，86.3(C-3)，72.1(C-4)，78.5(C-5)，172.8(C-6)，Xyl 106.4(C-1)，75.4(C-2)，77.8(C-3)，71.3(C-4)，67.9(C-5)。以上數(shù)據(jù)與文獻［10-11］對照一致，鑒定化合物為3-O-［β-D-吡喃木糖(1→3)β-D-吡喃葡萄糖醛酸］齊墩果酸。

化合物6:黃綠色粉末，ESI-MS m/z:477［MH］－，501［M+Na］+，315［M-162-1］－，分子式為C22H22O12。1H-NMR(DMSO-d6，500 MHz)δ:12.61(1H，s，5-OH)，8.02(1H，s，H-2')，7.50(1H，d，J=8.0 Hz，H-6')，6.90(1H，d，J=8.0 Hz，H-5')，6.44(1H，s，H-8)，6.20(1H，s，H-6)，5.51(1H，d，J=7.5 Hz，H-1″)，3.84(3H，s，3'-OCH3)。13C-NMR(DMSO-d6，500 MHz)δ:177.4(C-4)，164.5(C-7)，161.2(C-5)，156.4(C-9)，156.2(C-2)，149.4(C-3')，147.0(C-4')，133.1(C-3)，121.9(C-6')，121.1(C-1')，115.2(C-5')，113.5(C-2')，103.9(C-10)，101.6(C-1″)，98.8(C-6)，93.7(C-8)，75.9(C-2″)，73.1(C-5″)，71.3(C-4″)，67.9(C-3″)，60.3(C-6″)，56.0(3'-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻［12］對照一致，鑒定化合物為異鼠李素-3-O-β-D-半乳糖苷。

化合物7:白色粉末，ESI-MS m/z:949［M+Na］+，925［M-H］－，碎片峰763［M-162-1］－，631［M-162-132-1］－，分子式C47H74O18。1H-NMR(C5D5N，500 MHz)δ:0.82，0.90，0.93，1.00，1.10，1.30，1.31(each 3H，s，7×CH3)，3.20(H-3)，5.04(1H，d，J=7.5 Hz，H-1 of Glc)，5.39(1H，d，J=7.5 Hz，H-1of Xyl)，5.43(H-12)，6.35(1H，d，J=7.5 Hz，H-1 of Glc)。13CNMR(C5D5N，500 MHz)δ:39.1(C-1)，56.2(C-5)，19.0(C-6)，48.5(C-9)，47.5(C-17)，46.7(C-19)，42.7(C-14)，42.3(C-18)，40.4(C-8)，40.0(C-4)，37.5(C-10)，34.5(C-21)，33.7(C-7)，33.0(C-22)，31.3(C-20)，26.7(C-2)，28.4(C-15)，28.8(C-23)，27.1(C-27)，24.2(C-30)，24.2(C-11)，24.2(C-16)，16.0(C-25)，17.5(C-24)，18.0(C-26)，89.8(C-3)，123.4(C-12)，144.7(C-13)，177.0(C-28)，Glc 107.3(C-1)，75.2(C-2)，87.0(C-3)，72.0(C-4)，78.6(C-5)，172.8(C-6)，Xyl 106.7(C-1)，75.8(C-2)，78.1(C-3)，71.6(C-4)，67.9(C-5)，Glc 96.3(C-1)，74.7(C-2)，79.9(C-3)，71.5(C-4)，80.4(C-5)，62.7(C-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻［10-11］對照一致，鑒定化合物為3-O-［β-D-吡喃木糖(1→3)β-D-吡喃葡萄糖醛酸］齊墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物8:白色粉末，ESI-MS m/z:949［M+Na］+，925［M-H］－，碎片峰793［M-132-1］－，分子式C47H74O18。1H-NMR(C5D5N，500 MHz)δ:0.78，0.98，0.98，1.02，1.08，1.26，1.32(each 3H，s，7×CH3)，3.29(H-3)，5.01(1H，d，J=7.5 Hz，H-1 of Glc)，5.44(1H，H-1of Xyl)，5.46(H-12)，5.76(1H，d，J=7.5 Hz，H-1 of Glc)。13C-NMR(C5D5N，500 MHz)δ:39.1(C-1)，56.2(C-5)，18.9(C-6)，48.4(C-9)，47.2(C-17)，46.9(C-19)，42.6(C-14)，42.5(C-18)，40.2(C-8)，41.1(C-4)，37.4(C-10)，34.7(C-21)，33.8(C-7)，33.7(C-22)，31.5(C-20)，26.7(C-2)，28.6(C-15)，28.6(C-23)，27.1(C-27)，24.2(C-30)，24.2(C-11)，24.2(C-16)，15.9(C-25)，17.2(C-24)，17.9(C-26)，90.1(C-3)，123.0(C-12)，145.3(C-13)，180.7(C-28)，Glc 86.3(C-3)，72.1(C-4)，79.1(C-2)，77.9(C-5)，106.0(C-1)，172.5(C-6)，Xyl 105.5(C-1)，75.8(C-2)，79.1(C-3)，71.4(C-4)，67.9(C-5)，Glc 104.3(C-1)，77.0(C-2)，79.0(C-3)，73.0(C-4)，79.7(C-5)，63.8(C-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻［10-11］對照一致，鑒定化合物為3-O-［β-D-吡喃葡萄糖(1→2)β-D-吡喃木糖(1→3)β-D-吡喃葡萄糖醛酸］齊墩果酸。

4 體外抗真菌活性測試

4.1 供試品溶液制備取化合物5、7、8，分別以甲醇溶解，配制成5 mg/mL溶液，備用。

4.2 抗真菌活性測試采用紙片擴散法，分別吸取各供試品溶液10、20、40、80 μL于紙敏片(直徑6 mm)上，吹干后貼在白色念珠菌培養(yǎng)基平板上，蓋上陶瓦蓋，同時設空白對照，置于28℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)20 h，測量其抑菌圈直徑。結果顯示化合物8對白色念珠菌生長具有明顯抑制作用，其抑菌圈直徑達分別為8 mm、9 mm、11 mm、16 mm，而化合物5和7基本不顯示抑菌活性。

5 討論

中藥地膚子中含有較為豐富的皂苷類化學成分，已有化學研究也多集中于此，本研究首次從該植物中分離得到3個黃酮類化學成分，可為開展地膚子非皂苷類生物活性成分的研究提供了一定參考。

地膚子具有清熱利濕、祛風止癢之功效，多以復方中藥用于皮膚瘙癢等癥，現(xiàn)代藥理研究實驗顯示其水煎劑及醇提物對一些皮膚真菌有一定抑制作用，但其抗真菌活性成分并不明確。皂苷作為地膚子藥材中的主要成分，本研究中對提取分離得到多個地膚子皂苷單體成分進行初步的體外抗真菌活性測試，結果顯示其抗真菌活性程度不一，為深入開展地膚子皂苷類化學成分的抗真菌活性及其構效關系研究提供了一定的參考依據(jù)和研究基礎。

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