益智仁鹽炙前后對(duì)腎陽(yáng)虛多尿大鼠腎臟改善作用研究

李文兵，胡昌江*，吳珊珊，高源，龍?zhí)m艷，鐘振東

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川成都611137;2.四川省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，四川成都610031)

益智仁為姜科植物益智Alpinia oxyphylla Miq.的干燥成熟果實(shí)，本草文獻(xiàn)始見于唐·陳藏器《本草拾遺》。生品辛溫而燥，主要?dú)w脾經(jīng)，以溫脾止瀉、收攝涎唾力勝;鹽炙后可緩和辛燥之性，以溫腎固精縮尿?yàn)橹鳎纭缎奘轮改稀分赋?“益智仁鹽炒，止小便頻數(shù)”。中醫(yī)臨床上益智仁常作為君藥與烏藥、山藥配伍組成縮泉丸，用于治療下元虛冷，小便頻數(shù)，小兒遺尿等癥。課題組前期采用小鼠水負(fù)荷多尿模型已證明益智仁鹽炙后縮尿作用增強(qiáng)，且其物質(zhì)基礎(chǔ)是“石油醚部位+鹽”。本實(shí)驗(yàn)比較益智仁鹽炙前后有效部位對(duì)腺嘌呤致腎陽(yáng)虛多尿模型溫腎縮尿影響，擬從尿量、臟器指數(shù)、病理改變?nèi)齻€(gè)方面進(jìn)行研究，初步探討其作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD大鼠，雄性，體質(zhì)量180～220 g，清潔級(jí)，由四川達(dá)碩動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(川)2008-24。

1.2 藥物與試劑益智仁藥材產(chǎn)地為海南瓊中，經(jīng)本校生藥教研室盧先明教授鑒定確認(rèn)為姜科植物益智Alpinia oxyphylla Miq.的干燥成熟果實(shí)，鹽炙益智仁按篩選出的最佳工藝條件制得［1］。益智仁石油醚部位制備方法為8倍量95%乙醇提取3次，每次1 h，減壓回收乙醇，濃縮液用石油醚(60～90℃)萃取至上層無色，所得石油醚部位減壓回收后用吐溫80配成相應(yīng)給藥濃度。縮泉丸(廣東華天寶藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào):1005101)，腺嘌呤(成都貝斯特試劑有限公司，批號(hào):C2000-1360)。

1.3 儀器切片機(jī)(徠卡—1015，德國(guó));TSJ—Q型全自動(dòng)封閉式組織脫水機(jī);BMJ—Ⅲ型包埋機(jī);PHY—Ⅲ型病理組織漂烘儀(常州市中威醫(yī)療儀器有限公司);顯微鏡Motic BA400等;圖像分析軟件Motic Images Advanced。

1.4 分組及給藥取SD大鼠50只，隨機(jī)分為正常組、模型組、縮泉丸組、生品組、鹽炙品組，每組10只動(dòng)物。除正常組外，其余各組大鼠均按腺嘌呤200 mg/kg劑量灌胃1個(gè)月，從造模后2周即實(shí)驗(yàn)第3周開始，連續(xù)灌胃給藥4周，縮泉丸組給藥劑量為1.5 g/kg，生品、鹽炙品組劑量為成人日服劑量60倍即9 g生藥/kg［2］。實(shí)驗(yàn)6周后，測(cè)24 h尿量后，處死，分別取腎上腺、腎臟、脾臟、胸腺稱定質(zhì)量，計(jì)算臟器指數(shù)。并將右腎于10%福爾馬林中固定。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)尿量的影響與模型組相比，縮泉丸組、生品組和鹽炙品組大鼠24 h尿量均降低，具有顯著性差異(P＜0.05)，表明益智仁石油醚部位對(duì)腺嘌呤致腎陽(yáng)虛多尿大鼠有縮尿作用，結(jié)果見表1。

表1 對(duì)腎陽(yáng)虛多尿模型大鼠尿量影響(±s，n=8)Tab.1 Effects of urine volume on the kidneys of rats with the polyuria model of yang-deficiency(±s，n=8)

表1 對(duì)腎陽(yáng)虛多尿模型大鼠尿量影響(±s，n=8)Tab.1 Effects of urine volume on the kidneys of rats with the polyuria model of yang-deficiency(±s，n=8)

注:與正常組比較，＊＊P＜0.01;與模型組比較，▲P＜0.05。

/mL正常組組別劑量/(g·kg－1)尿量20.81±4.10模型組－31.71±4.60＊＊縮泉丸1.523.95±3.96▲生品組924.61±4.43▲鹽炙組924.23±4.68－▲

2.2 對(duì)臟器指數(shù)的影響與模型組相比，各給藥組腎上腺指數(shù)均降低，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。縮泉丸組和鹽炙品組腎臟指數(shù)與模型組相比具有極顯著性差異(P＜0.01)，生品組具有顯著性差異(P＜0.05)。脾臟指數(shù)與模型組比較，縮泉丸組、生品和鹽炙品組均具極顯著性差異(P＜0.01)。胸腺指數(shù)與模型組相比，各組均具極顯著性差異(P＜0.01)。表明益智仁石油醚部位對(duì)腎陽(yáng)虛多尿大鼠腎臟、脾臟、胸腺具有保護(hù)作用，且對(duì)腎臟保護(hù)作用以鹽炙品組最佳，結(jié)果見表2。

表2 對(duì)腎陽(yáng)虛多尿模型大鼠臟器指數(shù)影響±s，n=8)Tab.2 Effects of organ index on the kidneys of rats with the polyuria model of yang-deficiency±s，n=8)

表2 對(duì)腎陽(yáng)虛多尿模型大鼠臟器指數(shù)影響±s，n=8)Tab.2 Effects of organ index on the kidneys of rats with the polyuria model of yang-deficiency±s，n=8)

注:與正常組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;▲P＜0.05，與模型組比較，▲▲P＜0.01。

組別腎上腺/‰腎臟/‰脾臟/‰胸腺/‰正常組0.111 5±0.022 85.07±0.262.29±0.211.02±0.19模型組0.232 7±0.051 6＊＊20.98±3.10＊＊1.66±0.26*0.42±0.10＊＊縮泉丸0.184 7±0.025 816.03±1.92▲▲2.66±0.33▲▲0.93±0.18▲▲生品組0.195 8±0.045 816.26±2.77▲2.50±0.55▲▲0.88±0.14▲▲鹽炙組0.167 5±0.037 515.67±1.97▲▲2.49±0.24▲▲0.83±0.21▲▲

2.3 對(duì)腎臟病理變化的影響

2.3.1 肉眼觀察正常組大鼠腎臟表面光滑、顏色鮮紅，質(zhì)地柔軟，大小適中;模型組大鼠腎臟表面凹凸不平，顏色灰白，質(zhì)地較硬，體積較正常組相比明顯增大;各給藥組腎臟體積較模型小、色澤、外觀明顯改善。

2.3.2 光鏡觀察正常組大鼠腎組織皮、髓質(zhì)分界清楚，腎小球、腎小管、腎間質(zhì)均無異常改變。模型組大鼠腎臟出現(xiàn)(1)腎小球病變:腎小球呈分葉狀，約2/3發(fā)生萎縮或代償性肥大，球囊壁毛細(xì)血管基底膜輕度增厚，系膜細(xì)胞增多。(2)腎小管病變:腎小管可見咖啡色腺嘌呤結(jié)晶，部分腎小管有萎縮變小或擴(kuò)張，擴(kuò)張的腎小管內(nèi)偶見蛋白管型或顆粒管型。多數(shù)腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生水腫，退變線粒體腫脹。水腫明顯的上皮細(xì)胞繼而發(fā)生壞死，或脫落掉入管腔內(nèi)形成細(xì)胞管壁。(3)腎間質(zhì)病變:腎間質(zhì)內(nèi)纖維組織明顯增生，伴淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞浸潤(rùn)，甚至形成淋巴濾泡狀結(jié)構(gòu)。少數(shù)小動(dòng)脈壁增厚，單核細(xì)胞內(nèi)亦可見咖啡色晶狀結(jié)晶。縮泉丸和益智仁鹽炙前后與模型組相比均有不同程度的改變，但對(duì)腎小管的病理改善作用以鹽炙品為佳，見圖1。

圖1 腎臟組織病理光鏡圖(HE，×200)Fig.1 Pictures of renal pathological(HE，×200)

3 討論

3.1 腺嘌呤致大鼠腎陽(yáng)虛是比較公認(rèn)動(dòng)物模型，模型表現(xiàn)符合中醫(yī)腎陽(yáng)虛典型證候，且造模成功后具有明顯尿量增加，是研究益智仁溫腎縮尿作用的理想模型。但該模型是通過對(duì)腎臟的直接毒性作用，而出現(xiàn)類似腎陽(yáng)虛的癥候表現(xiàn)［3］，且隨著病程的進(jìn)展，腎單位大量喪失，導(dǎo)致腎功能衰竭［4-6］。選用該模型研究時(shí)造模劑量和時(shí)間是關(guān)鍵，而目前對(duì)于該模型的文獻(xiàn)報(bào)道方法不盡相同［7-12］。因此，前期對(duì)造模劑量和時(shí)間進(jìn)行了預(yù)試，結(jié)果表明腺嘌呤劑量在200 mg/kg灌胃4周效果較為滿意。

3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，益智仁對(duì)腎陽(yáng)虛多尿模型大鼠腎臟、脾臟、胸腺指數(shù)均有顯著改善，但對(duì)腎臟作用鹽炙品較生品明顯增強(qiáng);對(duì)模型大鼠腎小球、腎小管和腎間質(zhì)病變與模型組相比，生品和鹽炙品均有明顯改善作用，但在電鏡下觀察，鹽炙品對(duì)腎小管壞死或萎縮、代償擴(kuò)張及上皮細(xì)胞水腫改善作用較生品強(qiáng)，這與益智仁鹽炙入腎，溫腎縮尿作用增強(qiáng)的傳統(tǒng)認(rèn)識(shí)一致，且進(jìn)一步驗(yàn)證了益智仁溫腎縮尿物質(zhì)基礎(chǔ)是“石油醚部位+食鹽”的正確性。

［1］李興迎，胡昌江，林輝，等.中藥益智仁鹽炙工藝的正交實(shí)驗(yàn)法研究［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2008，19(7):1574-157.

［2］黃勤挽.益智仁鹽炙“縮尿”作用的研究［D］.成都:成都中醫(yī)藥大學(xué)，2008.

［3］彭成.中醫(yī)藥動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法學(xué)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2008:287.

［4］傅曉晴，武一曼，陳振彬，等.腺嘌呤制作腎陽(yáng)虛型慢性腎功能衰竭大鼠模型的電鏡病理學(xué)研究［J］.福建中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，12(3):41-43.

［5］Ali B H，Al-Salam S，Al Husseni I，et al.Effects of Gum Arabic in ratswith adenine-induced chronic renal failure［J］.Exp Biol Med(May-wood)，2010，235(3):373.

［6］劉洪彥，楊愛華，劉雪，等.腺嘌呤致大鼠慢性腎功能衰竭模型研究［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2011，15(12):2014-2017.

［7］鄭平東，朱燕俐，丁名城，等.腺嘌呤誘發(fā)“腎陽(yáng)虛”動(dòng)物模型的研制［J］.中國(guó)醫(yī)藥學(xué)報(bào)，1990，5(3):68-73.

［8］傅曉晴，林若勤，武一曼，等.腺嘌呤制作腎陽(yáng)虛型慢性腎功能衰竭大鼠模型的生化研究［J］.福建中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2003，13(1):22-24.

［9］肖靜，何立群，高建東，等.腺嘌呤與氫化可的松大鼠腎陽(yáng)虛模型造模方法比較［J］.中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2008，18(3):77-80.

［10］王家輝，陳東，周建國(guó)，等.腺嘌呤制作雄性Wistar大鼠腎陽(yáng)虛型不育癥動(dòng)物模型最佳時(shí)效和量效的小樣本研究［J］.中華男科學(xué)雜志，2008，14(6):565-570.

［11］操紅纓，吳清和，黃萍，等.縮泉丸對(duì)腎陽(yáng)虛多尿大鼠腎臟病理的影響［J］.中國(guó)現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2009，3(14):59-60.

［12］李蕊，劉曼麗，田心，等.不同劑量腺嘌呤誘導(dǎo)腎陽(yáng)虛不育大鼠模型實(shí)驗(yàn)研究［J］.安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，29(2):41-44.