參葛顆粒質量標準研究

駱慧琳，謝燕*，李國文，張彤，高月求

(1.上海中醫藥大學，上海201203;2.上海中醫藥大學附屬曙光醫院，上海201203)

參葛顆粒是由丹參、葛根、片姜黃等六味中藥組成的中藥復方制劑，具有健脾祛濕，化瘀消痰的功效，藥理實驗和臨床研究［1］表明對非酒精性脂肪肝病(Alcoholic Fatty Liver Disease，NAFLD)有較好的療效。為了控制該制劑的質量，保證臨床用藥安全有效，通過實驗研究及調閱文獻［2-4］，采用薄層色譜鑒別方法對女貞子、片姜黃、葛根、丹參進行定性鑒別，以葛根中葛根素和丹參中丹酚酸B作為定量測定的指標成分，并建立定量測定方法，所建立的方法能客觀反映參葛顆粒的品質，對其質量進行有效控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器Agilent 1100高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司);Kromasil 100-5C18色譜柱(AKZO NOBEL公司);CAMAG ATS4全自動點樣儀、CAMAG Reprostar 3數碼成像系統(瑞士卡瑪公司);Sartorius CPA225D電子天平(賽多利斯公司)。

1.2 試藥參葛顆粒(自制，批號:110901、110902、110903)，齊墩果酸對照品(批號:110709-200505)，片姜黃對照藥材(批號:121006-200903)，丹參對照藥材(批號:120923-200912)，葛根對照藥材(批號:121551-200902)，葛根素對照品(批號:110752-200912)，丹酚酸B對照品(批號:111562-200908)均購于中國藥品生物制品檢定所。硅膠G、GF254(青島海洋化工廠分廠)，甲醇(色譜級，霍尼韋爾公司)，純化水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 薄層鑒別

2.1.1 女貞子薄層鑒別取本品研至細粉狀，稱取4 g，加50 mL三氯甲烷，超聲30 min，抽濾，濾液至蒸發皿中低溫蒸發有機溶劑至干，殘渣加1 mL甲醇溶解，離心，取上層溶液作為供試品溶液。再取按處方比例及工藝制備的缺女貞子陰性對照樣品8 g，按上述方法和步驟制成陰性對照溶液;另取適量的齊墩果酸對照品，至10 mL量瓶中，加甲醇超聲溶解并稀釋至刻度，制成1 mg/mL的齊墩果酸對照品溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2010版一部附錄VIB)試驗，吸取上述溶液各4 μL，用全自動點樣儀點于同一硅膠G薄層板上使成條帶狀，把環己烷-丙酮-乙酸乙酯(5∶2∶1)作為展開劑［5］，展開至前沿線，取出，晾干后均勻噴灑10%硫酸乙醇溶液，置加熱板上105℃加熱至斑點顯色清晰，于紫外燈366 nm下觀察熒光，結果見圖1。陰性對照未見干擾，而供試品與齊墩果酸在相應的位置上，顯示相同顏色的熒光斑點。

圖1 女貞子薄層色譜圖Fig.1 TLC chromatogram of Ligustri lucidi Fructus

2.1.2 片姜黃薄層鑒別［6］取本品研至細粉狀，稱取4 g，加20 mL水超聲10 min，濾過，濾液用石油醚(30～60℃)萃取3次，每次20 mL，合并石油醚層，濃縮至0.5 mL，作為供試品溶液。再取按處方比例及工藝制備的缺片姜黃陰性對照樣品4 g，按上述方法和步驟制成陰性對照溶液;另取0.4 g片姜黃對照藥材，加2 mL石油醚(30～60℃)，超聲30 min，離心，取上清液，濃縮至0.5 mL，作為對照藥材溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2010版一部附錄VIB)試驗，吸取供試品溶液、陰性對照溶液、對照藥材溶液1 μL、2 μL、2 μL，用全自動點樣儀分別點于同一硅膠G薄層板上使成條帶狀，把石油醚(30～60℃)-乙酸乙酯(17∶3)作為展開劑，展開至前沿線，取出，晾干后均勻噴灑5%香草醛硫酸溶液顯色，置加熱板上100℃加熱至斑點清晰，白光下檢視，結果見圖2。陰性對照未見干擾，而供試品與對照藥材在相應的位置上，顯示相同顏色的斑點。

2.1.3 葛根薄層鑒別取本品研至細粉狀，稱取0.1 g，加50 mL 25%甲醇超聲30 min，濾過，水浴蒸干，殘渣加1 mL甲醇溶解，離心，棄去沉淀，取上層液體作為供試品溶液。再取按處方比例及工藝制備的缺葛根陰性樣品0.1 g，按上述方法和步驟制成陰性對照溶液;另取0.2 g葛根對照藥材，同上述處理制成對照藥材溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2010版一部附錄VIB)試驗，吸取上述溶液各1 μL，用全自動點樣儀分別點于同一硅膠G薄層板上使成條帶狀，把環己烷-丙酮-乙酸乙酯(5∶2∶1)作為展開劑，展開至前沿線，取出，晾干，用氨水熏10 min［7-8］，在紫外燈254 nm下觀察熒光，結果見圖3。陰性對照未見干擾，而供試品與對照藥材在相應的位置上，顯示相同顏色的熒光斑點。

圖2 片姜黃薄層色譜圖Fig.2 TLC chromatogram of Wenyujin Rhizoma Concisum

圖3 葛根薄層色譜圖Fig.3 TLC chromatogram of Puerariae lobatae Radix

2.1.4 丹參薄層鑒別取本品研至細粉狀，稱取0.2 g，加50 mL 25%甲醇超聲30 min，濾過，水浴蒸干，殘渣用1 mL甲醇溶解，離心，棄去沉淀，取上層液體作為供試品溶液。再取按處方比例及工藝制備的缺丹參陰性樣品0.2 g，按上述方法和步驟制成陰性對照溶液;另取0.2 g丹參對照藥材，同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2010版一部附錄VIB)試驗，吸取上述溶液各3 μL，用自動點樣儀分別點于同一硅膠GF254薄層板上使成條帶狀，把甲苯-乙酸乙酯-甲酸(8∶5∶0.8)作為展開劑［9］，展開至前沿線，取出，晾干后在紫外燈366 nm下觀察熒光，結果見圖4。陰性對照未見干擾，而供試品與對照藥材在相應的位置上，顯示相同顏色的熒光斑點。

圖4 丹參薄層色譜圖Fig.4 TLC chromatogram of Salviae miltiorrhizae Radix et Rhizoma

2.2 定量測定

2.2.1 葛根素

2.2.1.1 色譜條件Kromasil-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5.0 μm);以甲醇-水(25∶75)為流動相;檢測波長為250 nm［10］。理論板數按葛根素峰計算應不低于4 000［11］。

2.2.1.2 對照品溶液的制備取適量葛根素對照品，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含葛根素100 μg的溶液。

2.2.1.3 供試品溶液的制備取本品粉末約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50 mL 25%甲醇，密塞，稱定質量，超聲10 min，放冷后再稱定質量，用25%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2.1.4 線性關系考察取適量葛根素對照品精密稱定后置于10 mL量瓶中，以甲醇溶解并稀釋至刻度，以25%甲醇逐級稀釋，分別得到質量濃度為1.82、4.56、9.12、22.81、38.02、47.52 μg/mL的對照品溶液。精密吸取上述葛根素對照品溶液10 μL注入高效液相色譜儀，按2.2.1.1項下色譜條件測定，以葛根素質量濃度(X)為橫坐標，以峰面積(Y)為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程Y=43.365X－15.474，r=0.999 8。結果表明葛根素進樣量在0.018～0.480 μg范圍內與峰面積的線性關系良好。

2.2.1.5 穩定性試驗取同一供試品溶液，分別于配制后0、1、2、4、8、12 h重復進樣測定。以葛根素峰面積計算，RSD為0.87%，表明供試品溶液在室溫下放置12 h基本穩定。

2.2.1.6 重復性試驗取同一批號供試品6份，按照正文定量測定方法操作并測定，其含有量的RSD為0.32%，表明本方法重復性較好。

2.2.1.7 精密度試驗精密吸取同一對照品溶液(質量濃度為21.50 μg/mL)10 μL，相同條件下重復進樣6次，求得葛根素峰面積的RSD為0.56%，結果表明該儀器有良好的精密度。

2.2.1.8 回收率試驗精密稱取已知葛根素含有量的同一批號樣品9份，按相當于參葛顆粒中葛根素量的80%、100%、120%(即低、中、高劑量組)加入葛根素對照品溶液，按2.2.1.3項下方法制備供試品溶液，注入高效液相色譜儀，依法測定，計算回收率。結果見表1。葛根素的平均回收率為103.17%，RSD為2.43%。

表1 葛根素回收率測定結果Tab.1 Results of recovery tests

2.2.1.9 空白試驗按照處方的組成和比例，取除葛根以外的其余藥味并按照工藝條件制成缺葛根的供試品。按2.2.1.3項下的方法制備成陰性樣品溶液。取陰性樣品溶液10 μL，按照2.2.1.1項下進行測定，色譜圖在葛根素相應的保留時間處沒有色譜峰，說明陰性樣品溶液無干擾。見圖5。

2.2.1.10 樣品測定取3批參葛顆粒(批號110901、110902、110903)適量，按2.2.1.3項下方法制備樣品，以葛根素對照品質量濃度為橫坐標(X)，相應的色譜峰峰面積為縱坐標(Y)，繪制隨行標準曲線，測得樣品的峰面積代入隨行標準曲線，計算葛根素含量。按2.2.1.1項下色譜條件進行含量測定，結果見表2。

圖5 葛根素對照品溶液(A)、供試品溶液(B)和陰性樣品溶液(C)HPLC色譜圖Fig.5 HPLC chromatograms of puerarin reference substance(A)，granules sample(B)and negative sample(C)

表2 參葛顆粒中葛根素的測定結果(n=3)Tab.2 DeterminationresultsofpuerarininShenge Granules(n=3)

2.2.2 丹酚酸B

2.2.2.1 色譜條件Kromasil-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5.0 μm);以甲醇-乙腈-1.67%甲酸水溶液(27∶10∶63)為流動相;檢測波長為286 nm。理論板數按丹酚酸B峰計算應不低于2 000［11］。

2.2.2.2 對照品溶液的制備取適量丹酚酸B對照品，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含丹酚酸B 40 μg的溶液。

2.2.2.3 供試品溶液制備取本品粉末約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50 mL 25%甲醇，密塞，稱定質量，超聲10 min，放冷后再稱定質量，用25%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2.2.4 線性關系考察取適量丹酚酸B對照品精密稱定后置于10 mL量瓶中，以甲醇溶解并稀釋至刻度，以25%甲醇逐級稀釋，分別得到質量濃度為201.49、80.60、50.37、30.22、15.11、9.07 μg/mL的對照品溶液。精密吸取上述葛根素對照品溶液10 μL注入高效液相色譜儀，按2.2.2.1項下色譜條件測定，以丹酚酸B質量濃度(X)為橫坐標，以峰面積(Y)為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程Y=596.13X－6.350 1，r=0.999 9。結果表明丹酚酸B進樣量在0.091～2.015 μg范圍內與峰面積的線性關系良好。

2.2.2.5 穩定性試驗取同一供試品溶液，分別于配制后0、1、2、4、8、12 h重復進樣測定。以丹酚酸B峰面積計算，RSD為1.25%，表明供試品溶液在室溫下放置12 h基本穩定。

2.2.2.6 重復性試驗取同一批號供試品6份，按照正文定量測定方法操作并測定，其含有量的RSD為0.71%，表明本方法重復性較好。

2.2.2.7 精密度試驗精密吸取同一對照品溶液(質量濃度為40.35 μg/mL)10 μL，相同條件下重復進樣6次，求得丹酚酸B峰面積的RSD為0.51%，結果表明該儀器有良好的精密度。

2.2.2.8 回收率試驗精密稱取已知葛根素含有量的同一批號樣品9份，按相當于參葛顆粒中丹酚酸B量的80%、100%、120%(即低、中、高劑量組)加入丹酚酸B對照品溶液，按2.2.2.3項下方法制備供試品溶液，注入高效液相色譜儀依法測定，計算回收率。結果見表3。丹酚酸B的平均回收率為101.38%，RSD為2.83%。

表3 丹酚酸B回收率測定結果Tab.3 Results of recovery tests of salvianolic B

2.2.2.9 空白試驗按照處方的組成和比例，取除丹參以外的其余藥味并按照工藝條件制成缺丹參的供試品。按2.2.2.3項下的方法制備成陰性樣品溶液。取陰性樣品溶液10 μL，按照2.2.2.1項下進行測定，色譜圖在丹酚酸B相應的保留時間處沒有色譜峰，說明陰性樣品溶液無干擾。見圖6。

圖6 丹酚酸B對照品溶液(A)、供試品溶液(B)和陰性樣品溶液(C)HPLC色譜圖Fig.6 HPLC chromatograms of salvianolic acid B re-ference substance(A)，granules sample(B)and negative reference(C)

2.2.2.10 樣品測定取3批參葛顆粒(批號110901、110902、110903)適量，按2.2.2.3項下方法制備樣品，按2.2.2.1項下色譜條件進行含有量測定，以丹酚酸B對照品質量濃度為橫坐標(X)，相應的色譜峰峰面積為縱坐標(Y)，繪制隨行標準曲線，測得樣品峰面積代入隨行標準曲線，

計算丹酚酸B含量。結果見表4。

表4 參葛顆粒中丹酚酸B的測定結果(n=3)Tab.4 Determination results of salvianolic acid B in Shenge Granules(n=3)

3 討論

在對片姜黃進行薄層鑒別中，供試品的處理方法曾經嘗試直接用石油醚(30～60℃)提取，但供試品溶液的斑點與對照藥材未能很好的對應，考慮到片姜黃的主要成分——揮發油可能由于經過β-環糊精包合，在有機溶劑中很難被提取出來，所以采用先以水提取后再以石油醚(30～60℃)萃取的方法處理樣品，結果斑點對應一致。

在葛根的薄層鑒別中，展開晾干后若立即在紫外燈254 nm下觀察，斑點很不明顯，需放置1～3 h才能使斑點清晰，后改用氨水熏蒸，只需10 min就可使斑點顯現。

在參葛方中，丹參為君藥，葛根為臣藥。丹參中的丹酚酸B具有抑制脂質過氧化反應及抗肝纖維化作用，其機制可能為丹酚酸B能清除氧自由基、抑制脂質過氧化反應，減少MDA的產生，從而減少肝細胞的損傷，抑制TGF-β的產生和HSC的增殖活化，具有抗肝纖維化作用［12］。葛根中的葛根素能明顯防治實驗性大鼠NAFLD，與辛伐他汀相比，葛根素能更高好地減輕脂類在肝臟中的積聚、降低炎癥反應、保護肝細胞［13］，兩者分別被2010年版《中國藥典》一部定為控制丹參、葛根質量的目標成分。故選擇丹參中的丹酚酸B和葛根中的葛根素作為控制本品質量的定量指標。

該質量控制方法簡便可靠、精密度高、分離效果好，可用于參葛顆粒的質量控制。

［1］陳亨平，姚君，陳招娣，等.參葛方配合飲食及運動療法干預非酒精性脂肪性肝炎的臨床研究［J］.中西醫結合肝病雜志，2009，19(5):273-275.

［2］王曉莉，劉成松.清瘟解毒分散片質量標準研究［J］.中國中醫藥信息雜志，2012，19(1):60-62.

［3］閻雪梅，賈凡.扶腎顆粒質量標準研究［J］.天津中醫藥大學學報，2011，30(4):234-237.

［4］嚴紅，閆雪梅，張妍，等.粘脂飲質量控制［J］.中國醫院藥學雜志，2009，29(20):1782-1784.

［5］姜寧華，吳素香，宋曉筠.β-環糊精包合五味子揮發油的工藝研究脂肪性肝炎的臨床研究［J］.浙江中醫雜志，2009，44(6):460-461.

［6］楊曉云，王麗，譚曉艷.補腎強身膠囊的質量標準研究［J］.黑龍江醫藥，2009，22(6):807-809.

［7］王蘇會，閆薈，王瑞.復聰顆粒質量標準研究［J］.中醫藥導報，2010，16(8):77-79.

［8］袁紅英，楊雪萍，張志國，等.利腦心膠囊質量標準的方法學研究［J］.實用醫藥雜志，2010，27(6):519-522.

［9］廖婉，傅超美，賈東艷，等.心可寧膠囊質量標準研究［J］.成都醫學院學報，2008，3(1):31-34.

［10］陸霄鶴.HPLC法測定兩種葛根中葛根素含量［J］.內蒙古中醫藥，2010，29(2):33-34.

［11］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］.北京:中國醫藥科技出版社，2010:313.

［12］王迎春，劉炎芳，朱瑞萍.丹酚酸B對大鼠非酒精性脂肪性肝炎的影響［J］.中國實用醫藥，2011，5(33):10-12.

［13］鄭培永，馬贊頌，柳濤，等.葛根素對非酒精性脂肪肝大鼠肝臟脂質的影響［J］.上海中醫藥雜志，2009，42(1):61-63.