大孔吸附樹脂純化貫葉連翹提取物的工藝

雷雪，劉富崗，楊云

(河南中醫(yī)學院藥學院，河南鄭州450008)

貫葉連翹Hypericum perforatum L.為藤黃科金絲桃屬的干燥地上部分［1］，其有效成分金絲桃素，具有明顯的抗抑郁、抗病毒、抗腫瘤，以及顯著的抗DNA、RNA病毒作用，并可用于治療艾滋病［2-5］。大孔吸附樹脂為一種有機高聚吸附劑，具有選擇性好、吸附容量大、解析容易、再生簡便等優(yōu)點［6］。目前市場上的貫葉連翹提取物普遍存在金絲桃素量較低的現(xiàn)象，嚴重阻礙了貫葉連翹藥材及其制劑的進一步開發(fā)利用［7］。為了得到金絲桃素量較高的貫葉連翹提取物，且國內外對貫葉連翹提取物的金絲桃素量應不低于0.3%為指標［8］，本實驗采用大孔吸附樹脂的方法純化貫葉連翹提取物，以金絲桃素為指標，對貫葉連翹提取物純化工藝進行靜態(tài)和動態(tài)吸附-解吸研究，最終選取LSA－10型大孔吸附樹脂，并確定其最佳純化工藝。

1 儀器與試藥

BS210S型電子天平(北京賽多利斯公司);LC—20AT高效液相色譜儀(日本島津公司);METTLER AE240電子分析天平(瑞士梅特勒-托利公司)等。

貫葉連翹藥材購于陜西渭南，經河南中醫(yī)學院藥學院董誠明教授鑒定為藤黃科金絲桃屬植物貫葉連翹的干燥地上部分;金絲桃素對照品(中藥固體制劑制造技術國家工程研究中心，批號:1158-080715);AB－8、S－8大孔吸附樹脂(南開大學化工廠);CAD－45、860021大孔吸附樹脂(山東魯抗股份有限公司);D101、DA－201大孔吸附樹脂(天津農藥總廠);DB－301、HPD－600大孔吸附樹脂(滄州寶恩化工有限公司);LSA－10、LSA－20、XDA－6大孔吸附樹脂(西安藍深交換吸附材料有限責任公司);SP－825大孔吸附樹脂(日本三菱化學公司);色譜甲醇(天津四友精細化學品有限公司);雙蒸水;其余所用試劑的均為分析純。

2 方法與結果

2.1 定量測定

2.1.1 色譜條件依利特Hypersil ODS2(5.0 mm×200mm，5 μm)［9］;檢測波長590 nm;柱溫30℃;檢測器為SPD—20A UV/VIS;流動相為甲醇-0.1 mol/L NaH2PO4(97∶3);體積流量1 mL/min。

2.1.2 標準曲線的繪制分別精密吸取對照品溶液1.0、2.0、5.0、10.0、15.0、20.0 μL進樣，按2.1.1項的色譜條件測定，以金絲桃素質量濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，進行線性回歸。回歸方程為:A=298 457C－469.54，r=0.999 9(n=6)，金絲桃素質量濃度在0.010 4～0.208 μg/mL內線性關系良好。

2.2 大孔吸附樹脂類型的選擇

2.2.1 上柱溶液的制備稱取貫葉連翹藥材粉末150 g，精密稱定，加10倍量95%乙醇回流提取2次，每次3 h，乙醇提取液于50℃減壓濃縮至150 mL，即得。

2.2.2 大孔吸附樹脂的預處理根據(jù)文獻報道的方法對大孔吸附樹脂進行預處理［10］。

2.2.3 靜態(tài)篩選最佳大孔吸附樹脂分別稱取處理好的大孔吸附樹脂S－8、AB－8、CAD－45、860021、DB－301、D101、DA－201、HPD－600、LSA－10、LSA－20、XDA－6、SP－825各5 g，置100 mL錐形瓶中，備用。

在處理好的12種大孔吸附樹脂中，精密加入上柱溶液10 mL，振搖，靜置吸附24 h，精密吸取未吸附溶液，并蒸干，加甲醇溶解，HPLC法測定金絲桃素，并計算各型號樹脂靜態(tài)飽和吸附量，靜態(tài)飽和吸附量=(樣品中金絲桃素量－吸附后濾液中金絲桃素量)/樹脂量(mg/g干樹脂)［11］。

濾出已吸附上柱溶液大孔吸附樹脂，置于100 mL具篩三角瓶中，依次以30、20、10 mL的95%乙醇超聲洗滌，合并洗滌液，于85℃水浴蒸干，用甲醇溶解殘渣并轉移至10 mL量瓶中并定容，用HPLC法測定金絲桃素，計算12種樹脂的靜態(tài)洗脫率，靜態(tài)洗脫率=(洗脫液濃度×洗脫液體積)/飽和吸附量×100%，結果見表1。

由表1可知，LSA－20、LSA－10、SP825、S－8、XDA－6 5種大孔吸附樹脂較其他類型的大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附量與洗脫率均較高，其靜態(tài)飽和吸附量為XDA－6＞LSA－10＞S－8＞LSA－20＞SP－825＞1.35 mg/g，靜態(tài)洗脫率為LSA－20＞LSA－10＞SP－825＞S－8＞XDA－6＞90%，所以選擇此5種大孔吸附樹脂對其進行動態(tài)情況下上柱溶液的吸附與解吸附能力考察。

表1 大孔吸附樹脂靜態(tài)篩選實驗結果Tab.1 Static selection results of macroporous resins

2.2.4 動態(tài)篩選最佳大孔吸附樹脂分別稱取處理好的LSA－10、LSA－20、S－8、SP825、XDA－6 5種不同型號的大孔吸附樹脂各10 g，分別取上柱溶液40 mL上樣，控制體積流量為1 mL/min，預吸附2 h，過柱液重吸附一次，靜置12 h。收集過柱液，然后用蒸餾水洗至無色，再用80%乙醇洗至無色，分別收集各段洗脫液，測定金絲桃素濃度，并計算各部分金絲桃素的量。按下式分別計算比上柱量、比吸附量、比洗脫量。比上柱量=(上柱樣品液中金絲桃素的量-過柱液中殘余金絲桃素的量)/樹脂質量;比吸附量=(上柱樣品液中金絲桃素的量-過柱液中殘余金絲桃素的量-水洗脫液中金絲桃素的量)/樹脂質量;比洗脫量=80%乙醇洗脫部分金絲桃素的量/樹脂質量，結果如圖1。

圖1 5種大孔吸附樹脂動態(tài)吸附性能實驗Fig.1 Dynamic absorption experiments of 5 kinds of macroporous resins

從圖1可以看出，LSA－10在動態(tài)篩選大孔吸附樹脂實驗的各指標均為最優(yōu)，結合靜態(tài)試驗，LSA－10大孔吸附樹脂靜態(tài)洗脫率98.9%，靜態(tài)飽和吸附量1.924 0 mg/g，動態(tài)比柱量為1.954 2、比吸附量1.927 0、比洗脫量1.768 2，亦優(yōu)于其它類型樹脂，因此選用LSA－10大孔吸附樹脂純化貫葉連翹提取物。

2.3 LSA－10型大孔吸附樹脂的工藝參數(shù)考察

2.3.1 不同質量分數(shù)乙醇動態(tài)洗脫效果的考察稱取處理好的LSA－10型大孔吸附樹脂10 g，精密稱定。取上柱溶液40 mL，控制體積流量1 mL/min上柱，預吸附2 h，過柱液重吸附一次，靜置12 h。收集過柱液，分別以5 BV的蒸餾水、20%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇洗脫，每瓶收集1 BV的洗脫液，共收集30份，其中1～5為蒸餾水洗脫液，6～10為20%乙醇洗脫液，11～16為50%乙醇洗脫液，17～22為70%乙醇洗脫液，23～30為95%乙醇洗脫液。將收集到的各洗脫液85℃水浴蒸干，測定金絲桃素。以金絲桃素量(Y)為縱坐標，收集量瓶的編號(X)為橫坐標，繪制洗脫曲線，結果見圖2。

圖2 LSA－10型大孔樹脂吸附金絲桃素梯度洗脫曲線Fig.2 Gradient elution curve of adsorption hypericin by LSA－10

圖2結果表明，50%、70%、95%乙醇洗脫液為金絲桃素的主要存在部位，占金絲桃素總量的97.67%。而其中50%和70%乙醇洗脫液中金絲桃素量占總量的85.04%，95%乙醇洗脫液中金絲桃素量較少。70%乙醇的極性小于50%乙醇，相對而言可洗脫下的水溶性雜質較少，可基本涵蓋50%乙醇洗脫液可以洗脫的金絲桃素量，且綜合考慮減少操作工序，節(jié)約生產成本等因素，初步確定洗脫條件為先用蒸餾水、20%乙醇洗去水溶性雜質，再以70%乙醇洗脫，收集70%乙醇洗脫部分。2.3.2洗脫劑用量的考察精密吸取上柱溶液35 mL上柱，依次用蒸餾水、20%乙醇、70%乙醇洗脫，每瓶收集1 BV的洗脫液，依次按1，2，3，…編號，分別濃縮至干，測定每份洗脫液中金絲桃素量。以金絲桃素量(Y)為縱坐標，收集量瓶編號(X)為橫坐標繪制洗脫曲線，如圖3。

圖3 70%洗脫劑用量對金絲桃素洗脫終點的判斷Fig.3 Judgment of elution endpoint of by 70%eluant volume

從圖3可知，當蒸餾水用量至4 BV、20%乙醇洗脫3 BV時，洗脫曲線已近橫軸且所收集的洗脫液幾乎無色，說明水溶性雜質已除去。采用70%乙醇洗脫，洗脫至8 BV時曲線已接近橫軸，且前8 BV洗脫液中金絲桃素量約占70%乙醇總洗脫量的96%以上，故確定洗脫液溶媒為8 BV 70%乙醇。

2.3.3 影響LSA－10型大孔樹脂吸附性能因素的正交試驗考察根據(jù)文獻［12］，大孔吸附樹脂的吸附性能與藥液濃縮比、柱徑高比、上樣體積流量等因素有關。本實驗采用L9(34)正交試驗篩選最佳上柱工藝條件。正交設計的因素水平表見表2。

表2 L9(34)正交設計因素水平Tab.2 L9(34)orthogonal design factors and levels

本正交試驗以70%乙醇洗脫液中金絲桃素量(以100 g貫葉連翹藥材計)為考察指標，結果見表3，方差分析見表4。

從表3、表4可知，影響因素大小的順序為B＞A＞C，且方差分析結果表明，A和B因素對實驗結果有顯著意義(P＜0.05)，最終確定最佳搭配為A2B1C2，即最佳方案為:藥液濃縮比為1∶1;層析柱半徑與柱高比為1∶20;藥液上樣體積流量為2 BV/h。

2.4 驗證試驗以最佳工藝條件進行放大實驗，經LSA－10型大孔吸附樹脂純化后，6批樣品中金絲桃素量均高于1.5%以上，且轉移率達70%以上。遠遠高于貫葉連翹提取物＞0.3%的國際標準，證明此工藝合理可行。

表3 正交試驗設計及結果Tab.3 Design and results of orthogonal tests

表4 方差分析(顯著性檢驗)Tab.4 Variance analysis chart(significance test)

3 討論

本實驗綜合考慮靜態(tài)吸附解吸與動態(tài)吸附兩方面對大孔吸附樹脂純化貫葉連翹提取物的影響，在靜態(tài)篩選大孔吸附樹脂實驗中，HPD－600大孔吸附樹脂的靜態(tài)飽和吸附量較高為1.353 8 mg/g，靜態(tài)解析率卻較低，說明HPD－600對金絲桃素的保留能力過強，較難洗脫;而D101、CAD－45的靜態(tài)解析率較高，靜態(tài)飽和吸附量卻較低，說明此兩類樹脂極性較大，保留金絲桃素的能力較弱，均不適于純化貫葉連翹提取物。而SLA－10大孔吸附樹脂既對金絲桃素具有較大吸附量，又且易吸附、易解吸，其靜態(tài)飽和吸附量為1.924 0 mg/g，靜態(tài)洗脫率為98.9%，動態(tài)比柱量為1.954 2、比吸附量為1.927 0、比洗脫量為1.768 2，可較高效的純化金絲桃素。在LSA－10型大孔吸附樹脂純化前，貫葉連翹提取物中金絲桃素量為0.38%，經其純化后，金絲桃素量高于1.5%，表明LSA－10適合于貫葉連翹金絲桃素的純化，且其最佳工藝條件為LSA－10型大孔吸附樹脂純化貫葉連翹提取物，以層析柱半徑與柱高比為1∶20;藥液濃縮比為1∶1，藥液上樣體積流量為2 BV/h，4 BV蒸餾水、3 BV 20%乙醇為除雜洗脫溶劑，收集8 BV的70%乙醇洗脫液，減壓回收，真空干燥，即得純化的貫葉連翹提取物。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］.北京:中國醫(yī)療科技出版社，2010:215.

［2］Klusa V，Germane S，Noldner M，et al.Hypericum extract and hyperforin:memory-enhancing properities in rodents［J］.Pharmacopsychiatry，2001，34(Supple 1):S61-S69.

［3］李宏，姜懷春，鄒國林.貫葉連翹活性成分研究新進展［J］.中草藥，2001，32(7):657-660.

［4］朱曉薇.貫葉金絲桃研究進展Ⅱ—藥代動力學、藥效學和臨床應用［J］.國外醫(yī)藥植物藥分冊，1998，13(4):153.

［5］朱曉薇.貫葉金絲桃研究進展Ⅲ—藥代動力學、藥效學和臨床應用(續(xù))［J］.國外醫(yī)藥植物藥分冊，1998，13(5):210.

［6］鬼雙贏，周亞球，柯仲成.D101型樹脂對芍藥苷吸附分離性能的研究［J］.中國實驗方劑學雜志，2006，12(2):25-27.

［7］盧群.貫葉連翹中金絲桃素的合成與積累研究進展［J］.廣東藥學院學報，2002，18(4):270-272.

［8］樊敏偉，宋崎，王冰，等.大孔吸附樹脂對貫葉連翹中苯并二蒽酮類成分的富集［C］//中國藥學會學術年會暨第八屆中國藥師周論文集，2008.

［9］郝鵬飛，劉富崗，雷雪，等.貫葉連翹中金絲桃素的提取及含量測定［J］.遼寧中醫(yī)雜志，2011，38(11):2241.

［10］王秀麗，張志榮，龔濤，等.從丹參中提取高純度的丹參酚酸B［J］.華西藥學雜志，2008，2(3):280-282.

［11］雷雪，楊云，劉富崗，等.大孔吸附樹脂純化貫葉連翹提取物的研究［C］//2011年中國藥學大會暨第11屆中國要是周論文集，2011.

［12］李月.葛心通滴丸制備工藝及質量標準研究［D］.沈陽:遼寧中醫(yī)藥大學，2006.