多指標正交試驗法優選決明子蒽醌類成分的提取方法

王瑩，王青，張偉東，王鵬遠，顧宜，王曉娟*

(1.陜西中醫學院藥學院，陜西咸陽712046;2.第四軍醫大學第三附屬醫院藥劑科，陜西西安710032)

決明子Cassiae Semen，又名草決明，為豆科植物決明Cassia obtusifolia L.或小決明Cassia tora L.的干燥成熟種子，全國大部分地區都有栽培，主產安徽、廣西、浙江和四川等地。其味甘、苦、咸，性微寒，歸肝、腎、大腸經，具有清肝明目、潤腸通便之功效。主治目赤澀痛，羞明多淚，頭痛眩暈，目暗不明，大便秘結［1］。目前研究報道的決明子提取方法主要是以大黃酚或大黃素的提取率為評價指標進行研究［2-4］，未見同時以游離蒽醌、蒽醌苷類含有量為指標的研究。由于大黃酚或大黃素作為評價指標的局限性，本實驗以橙黃決明素、大黃酸、黃決明素、決明素、蘆薈大黃素、1-去甲基決明素、大黃酚、大黃素甲醚8種游離蒽醌，決明子苷、2-葡萄糖基橙黃決明素、2-葡萄糖基決明素、2-葡萄糖基黃決明素4種蒽醌苷類及12種蒽醌總含有量為評判指標來篩選決明子藥材的最佳提取方法，為決明子中蒽醌類成分提取的樣品處理方法提供科學依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器LC—2010A高效液相色譜儀(日本島津制作所);DL—720超聲儀(浙江石浦海天電子儀器廠);BT125D分析天平(北京賽多利斯科學儀器有限公司)。

1.2 試藥決明子購自湖北荊州(經陜西中醫學院雷國蓮教授鑒定為豆科植物決明Cassia obtusifolia L.的干燥成熟種子);對照品決明子苷、2-葡萄糖基橙黃決明素、2-葡萄糖基決明素、2-葡萄糖黃決明素、橙黃決明素、大黃酸、黃決明素、決明素、蘆薈大黃素、大黃酚、1-去甲基決明素、大黃素甲醚購自西安昊軒生物科技有限公司(純度均大于98%);乙腈、甲醇(色譜純，美國Fisher公司)，水為實驗室自制三蒸水;其它試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件［5-7］Diamonsil C18(2)柱(150 mm×4.6 mm，5 μm);流動相為乙腈－0.1%甲酸水溶液梯度洗脫;體積流量1 mL/min;檢測波長280 nm;柱溫25℃;進樣量10 μL。梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Program of gradient elution

2.2 混合對照品溶液的配制分別精密稱取決明子苷2.64 mg、2-葡萄糖基橙黃決明素1.80 mg、2-葡萄糖基決明素2.02 mg、2-葡萄糖基黃決明素2.08 mg、橙黃決明素2.16 mg、大黃酸1.94 mg、黃決明素2.06 mg、決明素2.02 mg、蘆薈大黃素1.00 mg、1-去甲基決明素1.98 mg、大黃酚2.44 mg及大黃素甲醚2.95 mg至10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即為對照品貯備溶液。

分別精密量取上述對照品貯備溶液2.5、4.0、1.0、1.5、3.0、5.0、0.5、0.5、2.0、0.5、0.5、0.5 mL于25 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，即為混合對照品貯備液。各對照品的質量濃度分別為決明子苷26.4 μg/mL、2-葡萄糖基橙黃決明素28.8 μg/mL、2-葡萄糖基決明素8.08 μg/mL、2-葡萄糖基黃決明素12.48 μg/mL、橙黃決明素25.92 μg/mL、大黃酸38.8 μg/mL、黃決明素4.12 μg/mL、決明素4.04 μg/mL、蘆薈大黃素8.0 μg/mL、1-去甲基決明素3.96 μg/mL、大黃酚4.88 μg/mL、大黃素甲醚5.9 μg/mL。

2.3 供試品溶液的制備取決明子藥材粉末(過三號篩)約0.5 g，精密稱定。置圓底燒瓶中，按正交設計的9種工藝進行回流提取，過濾，合并濾液至50 mL量瓶中，用乙醇定容至刻度，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，取續濾液，即得。按2.1項下的色譜條件進行測定，色譜圖見圖1。

圖1 混合對照品(A)，決明子(B)的HPLC圖Fig.1 HPLC chromatograms of 12 reference substances(A)and sample of Cassiae Semen(B)

2.4 標準曲線的繪制精密吸取上述混合對照品貯備液0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、10.0 mL，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度。分別過0.45 μm微孔濾膜，按2.1項下的色譜條件進樣，色譜圖見圖1。以峰面積為縱坐標(Y)，各對應指標成分的質量濃度為橫坐標(X)，繪制標準曲線，得其回歸方程和相關系數，結果見表2。

2.5 精密度實驗精密吸取混合對照品貯備液稀釋5倍后的溶液，按2.1項下的色譜條件進行測定，連續進樣6次，記錄峰面積。結果決明子苷、2-葡萄糖基橙黃決明素、2-葡萄糖基決明素、2-葡萄糖黃決明素、橙黃決明素、大黃酸、黃決明素、決明素、蘆薈大黃素、1-去甲基決明素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積的RSD分別為0.58%、0.50%、0.93%、0.29%、0.61%、0.30%、0.94%、0.82%、0.75%、0.62%、0.39%、0.23%。

2.6 穩定性實驗精密吸取同一供試品溶液(試驗號:1)，按2.1項下的色譜條件分別在0、2、4、8、12、24 h測定，記錄峰面積。結果決明子苷、2-葡萄糖基橙黃決明素、2-葡萄糖基決明素、2-葡萄糖黃決明素、橙黃決明素、大黃酸、黃決明素、決明素、蘆薈大黃素、1-去甲基決明素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積的RSD分別為0.58%、0.98%、0.47%、0.55%、0.71%、0.73%、0.52%、0.96%、0.69%、0.74%、0.91%、0.90%。

表2 12個對照品的回歸方程、相關系數和線性范圍Tab.2 Regression equations，correlation coefficients and linearity ranges of the 12 reference substances

2.7 重復性實驗精密稱取決明子藥材粉末0.5 g(試驗號:1)，平行6份，制備供試品溶液，按2.1項下的色譜條件進行測定，記錄峰面積。結果決明子苷、2-葡萄糖基橙黃決明素、2-葡萄糖基決明素、2-葡萄糖黃決明素、橙黃決明素、大黃酸、黃決明素、決明素、蘆薈大黃素、1-去甲基決明素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積的RSD分別為0.27%、0.61%、0.46%、0.92%、0.79%、0.73%、0.68%、0.80%、0.68%、0.34%、0.74%、0.77%。

2.8 加樣回收率實驗取已知量的決明子藥材粉末6份(試驗號:1)，每份約0.25 g，精密稱定。分別精密加入決明子苷、2-葡萄糖基橙黃決明素、2-葡萄糖基決明素、2-葡萄糖黃決明素、橙黃決明素、大黃酸、黃決明素、決明素、蘆薈大黃素、1-去甲基決明素、大黃酚、大黃素甲醚的對照品貯備液各2.0、3.0、0.3、0.7、2.0、3.0、0.3、0.1、0.5、0.2、0.3、0.1 mL，制備供試品溶液，按2.1項下的色譜條件進行測定，計算回收率。結果決明子苷、2-葡萄糖基橙黃決明素、2-葡萄糖基決明素、2-葡萄糖黃決明素、橙黃決明素、大黃酸、黃決明素、決明素、蘆薈大黃素、1-去甲基決明素、大黃酚、大黃素甲醚的平均回收率分別為100.53%、101.22%、99.11%、102.56%、100.90%、99.73%、98.25%、101.11%、98.23%、96.41%、101.56%、100.67%，RSD分別為1.79%、2.08%、1.33%、1.97%、1.18%、1.81%、1.87%、2.31%、1.71%、2.61%、1.46%、2.05%。

2.9 正交試驗與結果根據單因素預實驗，選取影響提取工藝的主要因素乙醇質量分數(A)、提取時間(B)、溶劑倍量(C)和提取次數(D)進行L9(34)正交設計試驗，因素水平見表3。

表3 因素水平Tab.3 Factors and levels

以游離蒽醌、蒽醌苷類及12種蒽醌總質量分數為指標，選用L9(34)正交試驗表進行實驗，結果及方差分析見表4、5。由極差分析結果可知，影響游離蒽醌提取因素的重要性為A＞C＞B＞D;蒽醌苷類為A＞B＞C＞D;總質量分數為A＞B＞D＞C，且三者中因素A均具有顯著性差異，因素B只在總質量分數提取時有顯著性差異，而因素C、D均無顯著性差異，對蒽醌類成分的提取影響較小。綜合以上分析結果，最佳提取方法為A2B3C1D2或A2B3C1D1，從實驗操作簡便性和成本方面考慮，最終確定決明子中蒽醌類成分的最佳提取方法為A2B3C1D1，即50倍70%的乙醇回流提取1次，提取時間2 h。

2.10 驗證實驗精密稱取決明子粉末(過三號篩)約0.5 g共6份，按照上述優選的提取工藝進行提取。按2.1項下的色譜條件進行測定，結果見表6。

3 討論

本實驗比較了甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸水、乙腈-0.1%磷酸水、乙腈-0.1%甲酸水梯度洗脫系統對各種成分的影響，結果發現乙腈-0.1%甲酸水梯度洗脫時，12種蒽醌類化合物可以達到完全分離，可準確定量。

預實驗同時考察了甲醇，乙醇作為溶劑，超聲提取，回流提取對提取工藝的影響，最終確定用乙醇回流提取做正交試驗。通過正交試驗和方差分析可知乙醇質量分數和提取時間為主要影響因素，最佳提取方法為A2B3C1D2或A2B3C1D1，因素D不具有顯著性差異，從實驗操作簡便性和成本方面考慮，提取次數選為1次。固液比50倍為正交試驗設計的最低倍量，同時也考慮了更低倍量的溶劑，結果顯示50倍量提取效果依然最佳。故最終確定決明子蒽醌類的提取工藝為A2B3C1D1，即50倍量70%的乙醇提取1次，提取時間2 h。

表4 正交試驗結果Tab.4 Results of orthogonal test

表5 方差分析Tab.5 Analysis of variance

按優選的提取工藝A2B3C1D1進行驗證實驗，所得6次實驗的游離蒽醌、蒽醌苷類及12種蒽醌總含有量的RSD分別為0.72%，0.66%，0.57%，說明該提取方法穩定、重復性好。多年來國內外學者在決明子的化學成分方面做了大量研究，結果表明，決明子中含蒽醌類、萘駢吡喃酮類、脂肪酸類、氨基酸和無機元素等，主要有效成分為蒽醌類［8］，決明子中蒽醌類成分多種多樣，單一的評價指標不能全面準確的評價提取方法。本實驗采用多指標成分定量分析優選決明子提取方法，為決明子藥材研究中樣品處理過程提供了更全面、科學、高效的方法。

表6 驗證實驗結果(n=6)Tab.6 Verifying test results(n=6)

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