復(fù)方丹參滴丸增強(qiáng)氯吡格雷對高血脂癥小鼠血小板的抑制作用

姚麗梅，黃海定，朱偉*

(1.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院，廣東廣州5105202.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東省中醫(yī)藥科學(xué)院，廣東廣州510006)

中西藥聯(lián)用，在我國許多醫(yī)院已成臨床用藥的常規(guī)。有研究顯示:一些中藥和西藥合用會產(chǎn)生相互作用，因此，為了公眾的安全，有必要深入研究中西藥間相互作用［1-2］。氯吡格雷作為一種新型抗血小板藥物，已成為冠心病抗血小板藥物治療的基石［3］，復(fù)方丹參滴丸是丹參、三七及冰片組成的純中藥滴丸劑，目前已經(jīng)在全國多家醫(yī)院廣泛用于多種心血管疾病［4-5］，因此這兩種藥物在臨床合并使用的情況比較普遍，但兩者是否存在相互作用、會不會影響臨床療效尚無專門的研究。本研究采用高血脂小鼠模型，觀察復(fù)方丹參滴丸對硫酸氫氯吡格雷抗血小板功能的影響，并探討其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥物復(fù)方丹參滴丸(天津天士力制藥有限公司，批號:110317)，硫酸氫氯吡格雷(賽諾非安萬特(杭州)制藥有限公司，批號:2613)。

1.2 動物SPF級昆明種小鼠50只，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，購于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，實(shí)驗(yàn)動物許可證號為0086042。飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心SPF級環(huán)境中，在恒溫(20±24)℃、恒相對濕度(50±5)%條件下飼養(yǎng)，環(huán)境設(shè)施許可證號:SYXK(粵)2008-0094。

1.3 試劑膽固醇、膽酸鈉購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司(批號:20110412);抗小鼠單克隆熒光標(biāo)記抗體:CD41-PE-CY7，CD14-FITC，CD62P-PE;同型對照:Rat IgG1κ-PE-CY7，Rat IgG2aκ-FITC，Rat IgG1κ-PE等試劑均購自美國eBioscience公司;1%多聚甲醛、PBS緩沖液購自廣州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司;溶血素C購自美國貝克曼庫爾特公司;血脂測定試劑盒購自寧波美康生物科技有限公司(批號:20110412)。

1.4 儀器FC—500流式細(xì)胞儀(美國貝克曼庫爾特有限公司);Trilogy全自動血液生化分析儀(英國DREW公司)。

1.5 方法

1.5.1 動物分組及給藥先以基礎(chǔ)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，將小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，基礎(chǔ)飼料組(NCG)喂飼基礎(chǔ)飼料;高脂飼料組(HCG)喂飼高脂飼料(高脂飼料配方如下:2%膽固醇、0.5%膽酸鈉、5%蛋黃粉、10%動物油、82.5%標(biāo)準(zhǔn)飼料，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心加工制成);高脂飼料+氯吡格雷組、高脂飼料+復(fù)方丹參滴丸組、高脂飼料+聯(lián)合用藥組。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，各藥物治療組在造模第8周開始灌胃給藥，連續(xù)給藥2周。氯吡格雷的給藥量為21 mg/(kg·d)，復(fù)方丹參滴丸的給藥量為160 mg(生藥)/(kg·d)。小鼠自由攝食和飲水，每周稱量體質(zhì)量1次，按體質(zhì)量換算藥物的灌胃量，正常對照組灌服同體積蒸餾水。

1.5.2 血脂指標(biāo)測定飼養(yǎng)結(jié)束后，停止喂食24 h，摘眼球取小鼠血，常規(guī)分離血清，以血脂試劑盒在全自動生化分析儀上測定小鼠總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)。

1.5.3 血小板活化檢測在流式專用上樣管中，分別加入CD14-FITC和CD62P-PE抗體1 μL，CD41-PE-CY7抗體1.5 μL，再加入小鼠抗凝外周血5 μL，避光孵育15～20 min，加入1 mL預(yù)冷(2～8℃)的1%多聚甲醛，2～4℃避光20 min，24 h內(nèi)上機(jī)檢測。

1.5.4 單核細(xì)胞血小板聚集和中性粒細(xì)胞血小板聚集檢測在流式專用上樣管中，分別加入CD14-FITC抗體1 μL，CD41-PE-CY7抗體1.5 μL，再加入小鼠抗凝外周血50 μL，避光孵育15～20 min，加入溶血素C 500 μL，震蕩混勻，靜置待溶液透明，加入1 mL PBS混勻，上機(jī)檢測。用SS和CD14射門，分別收集單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞細(xì)胞5 000個(gè)，分別計(jì)算單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞細(xì)胞上CD41的表達(dá)百分率，分別表示單核細(xì)胞血小板聚集率和中性粒細(xì)胞血小板聚集率。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠體質(zhì)量和血脂水平的情況與基礎(chǔ)飼料組相比，高血脂癥4組小鼠的體質(zhì)量均明顯增加(P＜0.05)，見圖1。表1的數(shù)據(jù)顯示，高脂飼料組組小鼠血脂TC、TG和LDL-C均明顯高于基礎(chǔ)飼料組，各組HDL-C水平無顯著性差異，說明本實(shí)驗(yàn)高血脂癥小鼠模型的建立是成功的。

圖1 各組小鼠體質(zhì)量比較Fig.1 Comparison of mice weight in different groups

表1 不同組別小鼠血脂水平比較±s，n=10)Tab.1 Comparison of lipid levels in different groups of mice±s，n=10)

表1 不同組別小鼠血脂水平比較±s，n=10)Tab.1 Comparison of lipid levels in different groups of mice±s，n=10)

注:與基礎(chǔ)飼料組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與高脂飼料組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01;與高脂飼料+復(fù)方丹參滴丸組比較，◇P＜0.05，◇◇P＜0.01。

組別TC/(mmol·L-1)TG/(mmol·L-1)LDL-C/(mmol·L-1)HDL-C/(mmol·L-1)基礎(chǔ)飼料組1.04±0.08 2.31±0.291.00±0.070.29±0.051.01±0.08高脂飼料組4.19±0.31＊＊1.33±0.10﹡0.52±0.09＊＊1.05±0.10高脂飼料+氯吡格雷組3.50±0.57＊＊△1.23±0.22﹡0.41±0.06＊＊△◇◇1.02±0.08高脂、高脂飼料+復(fù)方丹參滴丸組3.87±0.47＊＊1.30±0.12＊＊0.52±0.07＊＊1.00±0.08高脂飼料+聯(lián)合用藥組3.01±0.64＊△△◇◇1.12±0.13＊＊△△◇◇0.37±0.06＊＊△△◇◇

2.2 各組小鼠血小板功能的比較圖2和表2數(shù)據(jù)表明，與基礎(chǔ)飼料組比較，高脂飼料組的活化血小板比例、單核細(xì)胞血小板聚集率和中性粒細(xì)胞血小板聚集率都有顯著性增加(P＜0.01)，高脂飼料+氯吡格雷組、高脂飼料+復(fù)方丹參滴丸組和高脂飼料+聯(lián)合用藥組的單核細(xì)胞血小板聚集率有顯著性增加(P＜0.01或P＜0.05)。與高脂飼料組相比，高脂飼料+氯吡格雷組、高脂飼料+復(fù)方丹參滴丸組和高脂飼料+聯(lián)合用藥組的活化血小板比例有顯著性降低(P＜0.01)，高脂飼料+氯吡格雷組、高脂飼料+復(fù)方丹參滴丸組和高脂飼料+聯(lián)合用藥組的中性粒細(xì)胞細(xì)胞血小板聚集率也有顯著性降低(P＜0.01或P＜0.05)，但高脂飼料+氯吡格雷組、高脂飼料+復(fù)方丹參滴丸組和高脂飼料+聯(lián)合用藥組的單核細(xì)胞血小板聚集率的差異無顯著性差異(P＞0.05)。

圖2 流式細(xì)胞儀分析活化血小板(A)、單核細(xì)胞血小板聚集(B)和中性粒細(xì)胞血小板聚集(C)的散點(diǎn)圖Fig.2 Scatter plot of activated platelets(A)，monocyte-platelet aggregation(B)and neutrophilplatelet aggregation(C)by flow cytometry

表2 不同組別小鼠血小板表達(dá)比率比較(±s，n=10)Tab.2 Expression ratio comparison of platelets in different groups of mice(±s，n=10)

表2 不同組別小鼠血小板表達(dá)比率比較(±s，n=10)Tab.2 Expression ratio comparison of platelets in different groups of mice(±s，n=10)

注:與基礎(chǔ)飼料組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與高脂飼料組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01;與高脂飼料+聯(lián)合用藥組比較，◇P＜0.05，◇◇P＜0.01。

組別活化血小板/%單核細(xì)胞血小板聚集率/%中性粒細(xì)胞細(xì)胞血小板聚集率/%28.02±5.867.24±2.6319.87±4.34高脂飼料組45.75±6.94＊＊13.55±3.93＊＊32.77±5.95＊＊高脂飼料+氯吡格雷組32.48±4.74＊△△◇◇11.46±2.33＊＊24.74±4.67△◇高脂、高脂飼料+復(fù)方丹參滴丸組32.62±5.90△△◇◇10.69±2.64*23.00±4.62△△◇高脂飼料+聯(lián)合用藥組20.15±3.78＊△△11.16±1.82*19.37±3.13基礎(chǔ)飼料組△△

3 討論

血小板極易激惹活化，樣本經(jīng)離心、洗滌等步驟，容易人為地導(dǎo)致體外血小板激活，影響檢測價(jià)值。本研究采用的全血法流式細(xì)胞術(shù)盡可能避免血小板體外醫(yī)源性激活，防止血小板亞群丟失，在檢測過程中不會受其它種類細(xì)胞或碎片的干擾，保證了檢測的特異性。本研究檢測指標(biāo)CD62p是血小板活化的特異性分子標(biāo)志物，它主要位于血小板的α顆粒膜上，同時(shí)存在于內(nèi)皮細(xì)胞的Weibel-Palada小體膜上，CD62p在未活化的內(nèi)皮細(xì)胞膜上有一定數(shù)量的基礎(chǔ)表達(dá)，在血小板活化時(shí)CD62p與血小板表面的質(zhì)膜融合，并在血小板膜上表達(dá)或出現(xiàn)在血漿中［6］。

臨床和實(shí)驗(yàn)研究表明，高脂血癥患者血小板活性增高，易發(fā)生心血管事件，其主要原因是高脂血癥損傷內(nèi)皮結(jié)構(gòu)和功能，使膠原暴露，促進(jìn)血小板的黏附和激活;高血脂狀態(tài)下，血小板自身源源不斷地?cái)z取膽固醇(TC)，結(jié)果血小板膜脂質(zhì)中的膽固醇/磷脂比例高于正常，使血小板膜流動性降低，影響血小板膜功能;血小板膜上的鈣離子通道周圍脂質(zhì)發(fā)生改變，鈣內(nèi)流明顯增加，導(dǎo)致凝血活性增強(qiáng)［7-8］。血小板的活化、黏附、聚集以及血小板因子的釋放不但可直接觸發(fā)急性冠脈綜合征，而且還是動脈粥樣硬化的重要致病因素［9］，隨著人們對血小板在心血管疾病發(fā)展進(jìn)程中關(guān)鍵作用的認(rèn)識不斷深入，抗血小板藥物治療已經(jīng)成為急性冠脈綜合征和冠狀動脈介入術(shù)等患者預(yù)防和治療的基石［10］，氯吡格雷則是臨床最常用的抗血小板藥物之一。近來許多研究發(fā)現(xiàn)，氯吡格雷與質(zhì)子泵抑制劑或他汀類藥物合用會增加患者心血管不良事件的風(fēng)險(xiǎn)［11-12］，國內(nèi)亦有關(guān)于中藥與氯吡格雷合用的研究［13-14］。作為活血化瘀代表性的中成藥，復(fù)方丹參滴丸常和氯吡格雷聯(lián)合使用，其目的在于解決氯吡格雷抵抗的問題，但這種聯(lián)合用藥缺少實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，存在一定的安全性問題，值得開展研究。本研究結(jié)果表明復(fù)方丹參滴丸對高血脂癥小鼠體質(zhì)量沒有影響，但可降低高血脂癥小鼠升高的總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇。高血脂癥小鼠的血小板處于高活化狀態(tài)，復(fù)方丹參滴丸和氯吡格雷均有抑制高血脂癥小鼠血小板活化的作用，兩者聯(lián)合使用具有協(xié)同效應(yīng)，復(fù)方丹參滴丸能顯著增強(qiáng)氯吡格雷抑制血小板活性的作用。

總之，今后還需要大規(guī)模臨床試驗(yàn)進(jìn)一步探討復(fù)方丹參滴丸對氯吡格雷藥動學(xué)和藥效學(xué)的影響。另外，復(fù)方丹參滴丸與氯吡格雷之間的相互作用是否的確產(chǎn)生不良轉(zhuǎn)歸尚須進(jìn)一步評價(jià)，因?yàn)樗幚韺W(xué)上明顯的藥物間相互作用，不一定就會在臨床上產(chǎn)生影響。

［1］Fugh-Berman A.Herb-drug interactions［J］.Lancet，2000，355(9198):134-138.

［2］Tachjian A，Maria V，Jahangir A.Use of herbal products and potential interactions in patients with cardiovascular diseases［J］.J Am Coll Cardiol，2010，55(6):515-525.

［3］Sabatine M S，Cannon C P，Gibson C M，et al.Addition of clopidogrel to aspirin and fibrinolytic therapy for myocardial infarction with ST-segment elevation［J］.N Engl J Med，2005，352(12):1179-1189.

［4］王怡，高秀梅，張伯禮.復(fù)方丹參滴丸治療心血管疾病的藥理與臨床研究［J］.天津中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，21(3):53-54.

［5］袁如玉，李廣平.復(fù)方丹參滴丸在心血管疾病防治中的多靶點(diǎn)作用［J］.中國新藥雜志，2009，18(5):377-380.

［6］Cambien B，Wagner D D.A new role in hemostasis for the adhesion receptor P-selectin［J］.Trends Mol Med，2004，10(4):179-86.

［7］Htun P，F(xiàn)ateh-Moghadam S，Tomandl B，et al.Course of platelet activation and platelet-leukocyte interaction in cerebrovascular ischemia［J］.Stroke，2006，37(9):2283-2287.

［8］Sch?fer A，Bauersachs J.Endothelial dysfunction，impaired endogenous platelet inhibition and platelet activation in diabetes and atherosclerosis［J］.Curr Vasc Pharmacol，2008，6(1):52-60.

［9］項(xiàng)榮，郭紅山，孫開琪.血小板:動脈粥樣硬化的誘導(dǎo)者和推動者［J］.中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào)，2010，32(5):777-780.

［10］Angiolillo D J，Suryadevara S，Capranzano P，et al.Prasugrel:a novel platelet ADP P2Y12 receptor antagonist.A review on its mechanism of action and clinical development［J］.Expert Opin Pharmacother，2008，9(16):2893-2900.

［11］張子龍.氯吡格雷與他汀類藥物的相互作用研究進(jìn)展［J］.遼寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，30(4):376-378.

［12］Ho P M，Maddox T M，Wang L，et al.Risk of adverse outcomes associated with concomitant use of clopidogrel and proton pump inhibitors following acute coronary syndrome［J］.JAMA，2009，301(9):937-944.

［13］吳彩鳳，殷惠軍，王景尚.抗血小板藥物抵抗［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2010，30(2):221-224.

［14］李麗，李艷紅，王寧生.當(dāng)歸、紅花與硫酸氫氯吡格雷抗血小板聚集的相互作用［J］.中藥新藥與臨床藥理，2009，20(1):14-17.