Toll樣受體信號通路與腦缺血中風*

周賽男 劉柏炎 蔡光先△

（1.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學省部共建中醫(yī)內(nèi)科學教育部重點實驗室，湖南 長沙 410007）

“中風”一病源于《內(nèi)經(jīng)》，病名有大厥、仆擊、偏枯等稱，如《素問·調(diào)經(jīng)論》曰“血之與氣并走于上，則為大厥”。中風也稱腦卒中，其中缺血性腦卒中約占中風患者的80%［1］。歷代醫(yī)家認為其病因多以風、火、痰、瘀、勞倦、氣虛等為主，而現(xiàn)代越來越多的證據(jù)表明炎癥參與其中［2］。與全身細菌感染類似，腦缺血后炎癥反應(yīng)也與先天免疫相聯(lián)系。先天免疫是利用Toll樣受體（tolllike receptors，TLRs）特定的免疫反應(yīng)，能快速啟動炎癥反應(yīng)。因此作為炎癥細胞信號級聯(lián)的途徑始發(fā)者—TLRs可能成為防治中風的新靶點。筆者總結(jié)了近年來國內(nèi)外有關(guān)TLRs與中風的文獻，現(xiàn)闡述如下。

1 TLRs和其配體

TLRs是1997年發(fā)現(xiàn)于人類中與果蠅Toll蛋白的同源物質(zhì)。TLRs屬于Ⅰ型跨膜糖蛋白，由胞外區(qū)、跨膜區(qū)及胞內(nèi)區(qū)3部分組成。目前在哺乳動物中至少發(fā)現(xiàn)13個成員，作為一類同源模式識別受體，TLRs主要通過特異識別病原相關(guān)分子模式（PAMPs）和損傷相關(guān)分字模式（DAMPs）來啟動免疫反應(yīng)，是先天性免疫系統(tǒng)的重要組成部分及連接獲得性免疫與先天性免疫的“橋梁”［3］。至今，已確認的TLRs家族成員在人類中有10個（TLR1-10），TLRs可分為幾個子族，每個子族識別相應(yīng)的PAMPs和 DAMPs［4］。TLR1、TLR2 和 TLR6 子族主要識別脂質(zhì)，而TLR3、TLR7、TLR8和TLR9子族主要識別核酸。不同TLR家族成員都有其特定的配體，例如，TLR2除了識別脂質(zhì)外，還可識別肽聚糖、脂阿拉伯甘露聚糖等［5］。

2 TLRs信號傳導途徑

TLRs與配體識別引起胞內(nèi)TIR結(jié)構(gòu)域二聚體化，同時TIR結(jié)構(gòu)域發(fā)生構(gòu)象改變，招募存在于胞漿內(nèi)的也含有TIR結(jié)構(gòu)域的接頭蛋白分子，此舉對TLRs信號傳遞至關(guān)重要。不同的TLRs家族成員所引發(fā)的生物學效應(yīng)不同，歸根于不同TLRs與配體識別后所招募不同的含有TIR結(jié)構(gòu)域的接頭蛋白分子所傳導信號不同。其中MyD88是第一個被鑒定出來的，也是最重要家族成員，它介導除TLR3外所有TLRs信號轉(zhuǎn)導，核因子-κB（NF-κB）和絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）產(chǎn)生炎性細胞因子［4］。相比之下，TRIF介導TLR3和TLR4信號傳導，導致轉(zhuǎn)錄因子IRF3和NF-κB活化MAPKs，產(chǎn)生I型干擾素和炎性細胞因子［6］。Mal和TRAM作為分類接頭分子，Mal負責招募 MyD88到 TLR2和 TLR4，TRAM負責招募 TRIF到TLR4。而新近發(fā)現(xiàn)的SARM分子與TLRs信號通路的相關(guān)性卻備受爭論。因此，TLRs所介導的信號傳導大致分為兩條通路，一條是依賴于MyD88的信號傳導，導致產(chǎn)生炎性細胞因子；另一條是依賴于TRIF的信號傳導，導致產(chǎn)生I型干擾素和炎性細胞因子。

3 TLRs與腦缺血

研究表明，TLRs在缺血腦組織廣泛表達。Ziegler G等［7］通過應(yīng)用缺血后老鼠大腦基因表達分析，觀察到短暫腦缺血誘導1 h后在mRNA水平TLR2、4和9表達顯著上調(diào)；Ziegler G等［7］還檢測了鼠腦缺血后TLR2蛋白表達，發(fā)現(xiàn)其主要集中在缺血后腦組織的小膠質(zhì)細胞，但在內(nèi)皮細胞，神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞也有選擇性表達。Lehnardt S等［8］報道大腦中動脈栓塞（MCAO）小鼠模型缺血性腦組織中TLR2蛋白主要表達病變相關(guān)的小膠質(zhì)細胞。張清等［9］采用免疫組織化學法觀察鼠腦缺血后TLR4在不同再灌注時間點缺血側(cè)腦組織的分布和表達，結(jié)果表明TLR4蛋白在皮質(zhì)缺血半影區(qū)及鄰近紋狀體區(qū)有表達，且在再灌注后1 h即達高峰。

3.1 TLR4 TLR4在中樞神經(jīng)系統(tǒng)先天免疫中起關(guān)鍵作用，越來越多的證據(jù)表明，TLR4在腦缺血中風中介導缺血性損傷作用。Caso JR等［10］使用TLR4突變短暫MCAO小鼠模型第一次證明了其在腦缺血的致病作用。這些基因突變小鼠在TLR4蛋白的胞內(nèi)域有一點突變位點，使得712位氨基酸由脯氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榻M氨酸，從而喪失受體功能。與野生型小鼠相比，TLR4突變小鼠腦缺血后梗死面積及體積減小，水腫減輕，神經(jīng)功能缺損改善，中風誘導的干擾素調(diào)節(jié)因子-1、可誘導氮氧化合酶及環(huán)氧合酶-2表達降低，促炎性細胞因子水平如腫瘤壞死因子和白細胞介素（IL）-6下降，直接誘發(fā)和介導腦損傷的基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-9 表達也降低［11］。因此，TLR4 基因敲除可能在缺血誘導小鼠腦損傷起神經(jīng)保護作用。另外，Gao Y等［12］用TLR4抗體阻斷小鼠腦組織缺血再灌注模型后觀察到腦組織在不同時間點后的MyD88表達，提示TLR4可能通過上調(diào)MyD88表達參與腦缺血再灌注損傷的炎癥反應(yīng)機制。臨床方面，Brea D等［13］收集了110例缺血性中風的患者，發(fā)現(xiàn)TLR4與中風的預后及病灶梗死體積均獨立相關(guān)。因此，無論是動物實驗還是臨床都表明TLR4可能成為治療中風的靶點。

TLR4促進缺血腦組織損傷，這一點研究者們可以達成共識，但是其促成腦損傷是由哪條信號傳導途徑頗具爭議。盡管Gao Y等［12］認為TLR4可能通過上調(diào)MyD88表達參與腦缺血再灌注損傷，但是有一些學者報道與之矛盾。Yang QW等［14］報告了MyD88基因敲除小鼠遭受短暫缺血模型中風的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)MyD88基因敲除和野生型小鼠相比腦梗死和神經(jīng)功能缺損程度無明顯差異。這表明TLR4可能通過TRIF獨立途徑促成缺血性損傷。但是Hua F等［15］也報告說，TRIF基因敲除小鼠與野生型小鼠相比缺血再灌注后腦梗死沒有減少，神經(jīng)功能缺損均未改善。這表明TLR4可能通過MyD88獨立的途徑介導缺血性損傷。但是Bolanle M 等［16］報道中斷Toll樣受體下游 MyD88或TRIF信號不能防止腦缺血。這提示TLRs信號介導腦缺血損傷可能存在其他的信號途徑，還有可能是由于MCAO模型的差異。總之，TLR4信號通路促成腦缺血損傷機制需作進一步研究。

3.2 TLR2 近來大量研究表明，TLR2與腦缺血損傷有關(guān)。Ziegler G等［7］報道，短暫腦缺血1 h后野生型小鼠腦組織TLR2在mRNA和蛋白質(zhì)水平都顯著上調(diào)，短暫局灶性腦缺血（1 h）2 d后，TLR2缺陷小鼠腦梗死體積顯著下降。其結(jié)論是TLR2上調(diào)和TLR2信號傳導途徑是局灶性腦缺血的重要事件并有使得缺血性損傷惡化。Lehnardt S等［8］得到類似的結(jié)論，他們報道，在局灶性腦缺血模型中，與野生型小鼠相比TLR2缺陷小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷較小，野生型小鼠腦缺血后TLR2 mRNA和TLR2蛋白上調(diào)。據(jù)Tang SC等［17］報道，在體外實驗中，與野生型小鼠相比，來自TLR2基因敲除和TLR4突變小鼠的神經(jīng)元遭受能源剝奪后誘導細胞死亡減少。在體內(nèi)試驗中，野生型小鼠腦缺血再灌注損傷后大腦皮層神經(jīng)元TLR2和TLR4的表達增加；與對照組野生型小鼠相比，TLR2或TLR4缺陷小鼠中風后引起腦損傷和的神經(jīng)功能缺損程度明顯減少。故其認為表達于神經(jīng)元的TLR2和TLR4通過細胞凋亡信號通路，使其容易遭受缺血死亡。

無論是通過小膠質(zhì)細胞還是神經(jīng)元本身，大多數(shù)學者認為TLR2信號導致中風引起的中樞神經(jīng)損傷。臨床方面，Brea D等［13］發(fā)現(xiàn)TLR2與中風的預后獨立相關(guān)，因此TLR2可望成為治療中風的另一靶點。令人振奮的是，最近Ziegler G等［18］又報道了關(guān)于體內(nèi)阻斷TLR2對實驗性中風中炎性細胞聚集和神經(jīng)損傷方面的保護作用。他們得到結(jié)論，TLR2介導白細胞和小膠質(zhì)細胞浸潤與神經(jīng)元死亡，這可以通過抑制TLR2減弱。這進一步支持了TLR2可望成為治療中風的靶點。

盡管多數(shù)報道表明，TLR2基因敲除鼠減小中風損傷，但是也有一些沖突的報道。Hua F等［19］報告說，與野生型小鼠相比，TLR2基因敲除鼠在短暫MCAO后腦梗死面積增加。這些不同的結(jié)果可能由MCAO模型差異造成，但也有可能是TLR2在腦缺血中還有其他功能。如Xiaoxia Z等［20］發(fā)現(xiàn)，炎癥和創(chuàng)傷愈合期間產(chǎn)生CEP（脂質(zhì)氧化的最終產(chǎn)品）被TLR2識別后導致血管內(nèi)皮生長因子非依賴的血管生成反應(yīng)。CEP通過TLR2-MyD88依賴性信號途徑促進后肢缺血及傷口愈合模型血管生成。這一發(fā)現(xiàn)為TLR2在腦缺血中的研究提供了一個新的方向。

3.3 其他TLRs 盡管短暫性腦缺血誘導后鼠TLR9 mRNA水平表達顯著上調(diào)［7］，但有研究報道它與腦缺血損傷沒有直接關(guān)系，如Hyakkoku K等［21］研究表明TLR3和TLR9信號通路與缺血再灌注引起大腦損傷沒有直接關(guān)系。Brea D等［22］分析TLR3、7、8和9的表達和缺血性中風炎癥分子的表達及患者的臨床結(jié)果的相關(guān)性，得到的結(jié)論是TLR7和TLR8表達與急性缺血性中風的不良結(jié)果及更強的炎癥反應(yīng)有關(guān)。

4 結(jié) 語

TLRs在腦缺血中起重要作用，是導致腦損傷的機制之一。大量研究表明TLR2、TLR4信號通路調(diào)節(jié)缺血誘導神經(jīng)元損傷的嚴重程度。這些結(jié)果提示，TLR2和TLR4可能是中風的治療靶點，而其他TLRs在缺血性中風的研究則有待進一步進行。中醫(yī)以其整體觀念的理論體系和辨證論治的治療方法，并歷經(jīng)數(shù)千年的臨床實踐，對中風病的治療積累了寶貴的經(jīng)驗。如王清任《醫(yī)林改錯》中的補陽還五湯，臨床用于治療氣虛血瘀證中風療效顯著，但其作用機理不明，不為國際所認證。而通過現(xiàn)代手段對中藥方劑的深入研究，不但為研究中醫(yī)藥的作用機理提供科學依據(jù)，也為研發(fā)治療中風的新藥物提供新策略，同時也為中醫(yī)藥治療腦血管病的現(xiàn)代化和國際化帶來新契機。

［1］徐寅平.中西醫(yī)綜合療法治療急性缺血性中風46例［J］.中醫(yī)雜志，2009，50（9）：814-815.

［2］QingW.The inflammatory responseinstroke［J］.JNeuroimmunol，2007，184（1-2）：53-68.

［3］Uematsu S，Akira S.Toll-like receptors and type I interferons［J］.Journal of biological chemistry，2007，282（5）：15319-15324.

［4］Akira S，Uematsu S，Takeuchi O.Pathogen recognition and innate immunity［J］.Cell，2006，124（4）：783-801.

［5］Hoshino K，Takeuchi O，Kawai T，et al.Cutting edge：Toll-like receptor 4（TLR4）-deficient mice are hyporesponsive to lipopolysaccharide evidence for TLR4 as the Lps gene product［J］.Journal of Immunology，1999，162（10）：3749-3752.

［6］Taro Kawai，Shizuo Akira.The role of pattern-recognition receptors in innate immunity：update on Toll-like Receptors［J］.Nature immunology，2010，11（5）：373-384.

［7］Ziegler G，Harhausen D，Schepers C，et al.TLR2 has a detrimental role in mouse transient focal cerebral ischemia［J］.Biochem Biophys Res Commun，2007，359（3）：574-579.

［8］Lehnardt S，Lehmann S，Kaul D，et al.Toll-like receptor 2 mediates CNS injury in focal cerebral［J］.J Neuroimmunol，2007，190（1-2）：28-33.

［9］張清，孫鵬，馮新民，等.Toll樣受體4蛋白在大鼠腦缺血再灌注損傷中的表達及其意義［J］.華中科技大學學報：醫(yī)學版，2008，37（2）：219-221.

［10］Caso JR，Pradillo JM，Hurtado O， et al.Toll-like receptor 4 is involved in brain damage and inflammation after experimental stroke［J］.Circulation，2007， 115（12）：1599-1608.

［11］Yakkoku K，Hamanaka J，Tsuruma K，et al.Toll-like receptor 4（TLR4）， but not TLR3 or TLR9， knock-out mice have neuroprotective effects against focal cerebral ischemia［J］.Neurosci，2010，171（1）：258-267.

［12］Gao Y，F(xiàn)ang X，Tong Y，et al.TLR4-mediated MyD88-dependent signaling pathway is activated by cerebral ischemia-reperfusion in cortex in mice［J］.Biomed Pharmacother，2009，63（6）：442-50.

［13］Brea D，Blanco M，Ramos-Cabrer P，et al.Toll-like receptors 2 and 4 in ischemic stroke：outcome and therapeutic values［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2011，31（7）：1424-1431.

［14］Yang QW，Li JC，Lu FL，et al.Upregulated expression of toll-like receptor 4 in monocytes correlates with severity of acute cerebral infarction［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2008，28（9）：1588-1596.

［15］Hua F， Wang J，Sayeed I，et al.The TRIF-dependent signaling path-way is not required for acute cerebral ischemia/reperfusion injury in mice［J］.Biochem Biophys Res Commun，2009， 390（3）：678-683.

［16］Bolanle M，Yongshan M.Disruption of downstream MyD88 or TRIF Toll-like receptor signaling does not protect against cerebral ischemia［J］.Brain Res，2011，1388（5）：148-156.

［17］Tang SC，Arumugam TV，Xu X， et al.Pivotal role for neuronal Tolllike receptors in ischemic brain injury and functional deficits［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA，2007，104（34）：13798-13803.

［18］Ziegler G，F(xiàn)reyer D，Harhausen D，et al.Blocking TLR2 in vivo protects against accumulation of inflammatory cells and neuronal injury in experimental stroke［J］.J Cereb Blood Flow Metab， 2011，31（2）：757-766.

［19］Hua， F，Ma J， Ha T，et al.Differential roles of TLR2 and TLR4 in acute focal cerebral ischemia/reperfusion injury in mice［J］.Brain Res，2009，1262（3）：100-108.

［20］Xiaoxia Z，Nikolay L，Alona A，et al.Oxidative stress induces angiogenesis by activating TLR2 with novel endogenous ligands［J］.Nature，2010，467（7318）：972-976.

［21］Hyakkoku K，Hamanaka J，Tsuruma K，et al.Toll-like receptor 4（TLR4）， but not TLR3 or TLR9， knock-out mice have neuroprotective effects against focal cerebral ischemia［J］.Neuroscience，2010，171（1）：258-267.

［22］Brea D，Sobrino T，Rodríguez-Yáez M，et al.Toll-like receptors 7 and 8 expression is associated with poor outcome and greater inflammatory response in acute ischemic stroke［J］.Clin Immunol，2011，139（2）：193-198.