復方靈尼膠囊對免疫抑制小鼠免疫功能影響的實驗研究

李玉梅，薛 欣，張永祥，盧賀起

(中國中醫(yī)科學院中醫(yī)基礎理論研究所，北京 100700)

復方靈尼膠囊在治療艾滋病的臨床實驗觀察中有較好的療效。為深入探討其療效機理，尤其是促進免疫功能的藥理作用機制，本實驗采用環(huán)孢霉素A誘導小鼠產生免疫抑制，觀察該藥對模型動物CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細胞及CD4+/CD8+比值的影響[1]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 雄性昆明小鼠72只，清潔級，體重20g±2g，由中國藥品生物制品檢定所實驗動物資源中心提供(許可證號SCXK(京)2009-0017)。

1.1.2 藥物 復方靈尼膠囊(批號20090401)，由中國熱帶農業(yè)科學院熱帶生物技術研究所提供，每克復方靈尼膠囊內裝物相當于5.44g生藥。成人臨床給藥劑量為10g生藥/人/d。將藥物分別配成濃度5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml的水溶液。

陽性對照藥:貞芪扶正顆粒(批號071110)，由修正藥業(yè)集團有限公司生產，將該藥配成濃度為56mg/ml的水溶液。造模用藥:環(huán)孢霉素注射液(批號S0026A)，瑞士大諾華，稀釋成濃度為1mg/ml工作液，用量為小鼠每公斤體重15mg。

1.1.3 主要試劑和儀器 試劑:FITC標記的美洲倉鼠抗小鼠CD3單克隆抗體，PE標記的大鼠抗小鼠CD4單克隆抗體，PECY5標記的大鼠抗小鼠CD8單克隆抗體，均購自美國eBioscience公司。儀器:日本Tomy SECKO公司高速低溫離心機RS-20IV型，美國貝克曼庫爾特公司流式細胞儀EPICS XL型。

1.2 方法

1.2.1 造模與分組 將72只小鼠分為A正常組、B低劑量組、C中劑量組、D高劑量組、E模型組、F陽性藥組6組，每組12只。除A組動物外，其他組動物均腹腔注射造模藥物，劑量0.3ml/20g，每隔1d注射1次，共注射3次。造模給藥1周后，除A組和E組動物外，其他組動物均口服灌胃給藥，每次0.5ml，B、C、D組給復方靈尼膠囊水溶液，F(xiàn)組給予貞芪扶正顆粒水溶液，每天1次，共持續(xù)14d。

停止給藥后次日，各組動物眼眶取血，肝素抗凝，取抗凝血與小鼠單克隆抗體工作液混勻，4℃避光放置30min，用紅細胞裂解液溶解紅細胞，離心1200r/5min，取沉淀細胞用PBS洗2次后，制成細胞懸液用300目尼龍網(wǎng)過濾，樣品上流式細胞儀檢測。

1.2.2 流式檢測條件和指標 流式細胞儀激光發(fā)射波長488nm，在前向散射和側向散射二維散點圖上確定淋巴細胞群，分別收集波長為525nm、575nm、670nm的熒光信號，并分別計算CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細胞百分率。

1.2.3 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計處理 實驗數(shù)據(jù)應用單因素方差分析，結合q檢驗進行，實驗結果用均數(shù)±標準差表示。

2 結果

復方靈尼膠囊對免疫抑制小鼠淋巴細胞亞群的影響

表1顯示，模型組小鼠CD3+、CD4+、CD8+淋巴細胞均明顯低于正常對照組(P＜0.01)，模型組小鼠CD4+/CD8+比值低于正常對照組，說明模型組小鼠免疫功能受到抑制。復方靈尼膠囊高、中、低劑量組與模型組比較，CD3+、CD4+、CD8+細胞明顯升高(P＜0.01)，中劑量組CD4+/CD8+比值亦有所恢復，說明復方靈尼膠囊具有提高和改善免疫功能的作用。

表1 復方靈尼膠囊對免疫抑制小鼠淋巴細胞亞群影響

表1 復方靈尼膠囊對免疫抑制小鼠淋巴細胞亞群影響

注:與正常組比較:*P＜0.05，＊＊P ＜0.01;與模型組比較:#P＜0.05，##P ＜0.01

組 別 例數(shù) CD3+ CD4+ CD8+ CD4+/CD8+正 常 組 12 72.87±9.04 51.06±7.78 21.15±3.21 2.45±0.46模 型 組 12 48.47±2.79＊＊ 33.10±2.74＊＊ 14.87±2.52＊＊ 2.14±0.36*陽性藥物組 12 74.66±8.68## 47.60±3.92## 26.58±2.15## 1.97±0.39低 劑 量 組 12 75.22±4.01## 48.90±4.39## 25.68±3.72## 1.96±0.40中 劑 量 組 12 73.26±9.56## 49.73±8.98## 23.14±6.38## 2.34±0.63高 劑 量 組 12 73.53±6.50## 47.44±7.97## 25.00±5.09##1.97±0.51

3 討論

CD4+T淋巴細胞在機體的免疫反應中處于重要地位，它通過分泌細胞因子激活其他細胞亞群參與免疫反應，協(xié)調其間的相互作用，并對介導體液免疫和細胞免疫起著重要調節(jié)作用。HIV病毒感染和艾滋病所引起的重要的病理損傷:HIV病毒主要攻擊CD4+T淋巴細胞，使CD4+T淋巴細胞受損，數(shù)量減少，免疫功能進行性下降，最終致使機體免疫功能喪失。CD4+T淋巴細胞的數(shù)量和功能變化是篩選抗艾滋病藥物的重要指標之一[2]。中醫(yī)認為，正氣存內，邪不可干，扶正可以祛邪，而補虛扶正是提高抗病能力、調節(jié)免疫功能的重要手段，這在很多人體的康復實踐中得到證實[3]。

在治療艾滋病的臨床實踐中，中醫(yī)藥治療可改善患者臨床癥狀，提高生存質量，推遲艾滋病的發(fā)病時間[4]。受試藥物是根據(jù)中醫(yī)扶正祛邪理論研制，在臨床觀察中有較好的療效。本次實驗數(shù)據(jù)顯示，模型組各指標平均值明顯低于正常組和陽性藥物組，有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，說明小鼠免疫抑制模型的實驗方法可靠。各劑量給藥組的各指標平均值與模型組比較均見升高且接近正常組水平，并與陽性藥物組各指標平均值無明顯差異(P＞0.05)，表明實驗藥物與陽性藥物藥效一致，即復方靈尼膠囊對免疫抑制模型小鼠的免疫功能有恢復作用。但實驗數(shù)據(jù)也同時顯示，各給藥組 CD4+/CD8+的比值并未恢復到正常組水平，應就其免疫調節(jié)的機制做進一步深入研究。

[1]張永祥，趙東，李玉梅，等.愛可扶正片對免疫抑制小鼠免疫功能恢復作用的實驗觀察[J].中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志，2007，13(3):216.

[2]金伯泉.細胞和分子免疫學[M].西安:世界圖書出版公司，1999:259-285.

[3]盧賀起，黃暉，周艷華，等.“時相藥法”消除運動性疲勞機理的初步研究[J].中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志，2006，12(9):665-667.

[4]閆利源，張毅.艾滋病的中醫(yī)病因病機及治療思路研究[J]中醫(yī)學報，2011，26(152):3-6.