手足口病新型抗病毒藥物的研究進(jìn)展

崔穎 崔向陽

手足口病新型抗病毒藥物的研究進(jìn)展

崔穎 崔向陽

手足口病已成為全球范圍嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，致病源EV71等腸道病毒基因不斷進(jìn)化，而與之對應(yīng)的卻是有效抗病毒藥物的缺乏，研制新型手足口病治療藥物已迫在眉睫。綜述基于病毒殼體蛋白、病毒RNA復(fù)制、病毒蛋白酶等分子靶點(diǎn)的新型手足口病抗病毒藥物的研究、開發(fā)進(jìn)展。

手足口病;抗病毒藥物;分子靶標(biāo)

手足口病(Hand，foot and mouth disease，HFMD)是一類急性病毒性疾病，引發(fā)手足口病的腸道病毒有20多種，其中以柯薩奇病毒A16型(Cox A16)、A10型和腸道病毒71型(EV71)最為常見［1，2］。5 歲以下兒童是主要的感染人群，引起以口腔炎及手足皮疹為主要臨床表現(xiàn)的疾?。?］，尤其是腸道病毒EV71感染所致的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥可導(dǎo)致死亡或永久性肌麻痹，在世界各地不斷出現(xiàn)暴發(fā)流行［4］。2008世界衛(wèi)生組織WHO在中國流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)每50萬HFMD人群中就有200個(gè)死亡案例，目前HFMD已成為中國面臨的第二大類病毒感染疾病，手足口病已被列入《中華人民共和國傳染病防治法》規(guī)定的丙類傳染病進(jìn)行管理。

目前尚沒有公認(rèn)的手足口病特效治療藥物，臨床常使用阿昔洛韋、伐昔洛韋、更昔洛韋、利巴韋林等常規(guī)抗病毒藥物，并結(jié)合板藍(lán)根、注射用雙黃連、清開靈沖劑等具有清熱、解毒、退熱療效的中藥制劑，用于手足口病治療，研發(fā)特異性治療藥物已迫在眉睫。伴隨著病毒基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)的快速發(fā)展，基于分子靶標(biāo)水平研發(fā)新型手足口病抗病毒藥物進(jìn)入了一個(gè)新的時(shí)代，部分藥物已進(jìn)入Ⅱ、Ⅲ期臨床試驗(yàn)階段。

1 病原病毒的分子生物學(xué)特征

柯薩病毒(CoxA和CoxB)、?？刹《竞托履c道病毒等病原均隸屬于小RNA病毒科，盡管種類繁多、型別各異，但均具有相似的理化生物學(xué)特性：病毒顆粒極小，直徑20～30 nm，呈二十面體立體對稱球形結(jié)構(gòu)。

腸道病毒71型(EV71)是其中一類研究較為透徹的病毒，基因組長度約為7500bp，僅有一個(gè)開放閱讀框，在其兩側(cè)為5'和3'非編碼區(qū)［5］。開放閱讀框首先編碼一個(gè)約2 190個(gè)氨基酸的多聚蛋白，多聚蛋白進(jìn)一步被水解成P1、P2和P3三個(gè)前體蛋白。前體蛋白P2和P3降解成七個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白：包括 2A(特異性蛋白水解酶) 、2B、2C、3A、VPg(5'蛋白水解酶)、3C(特異性蛋白水解酶)、3D(RNA聚合酶組分)。其中2A蛋白水解酶在P1前體蛋白的N末端位點(diǎn)進(jìn)行剪切，將P1蛋白從多聚蛋白中解離下來;3C蛋白水解酶進(jìn)一步將P1前體蛋白剪切成VP1、VP2、VP0(VP3和VP4)等病毒外殼蛋白［5］。病毒顆粒衣殼包括60個(gè)亞單位，分別由4種衣殼蛋白拼裝成五聚體樣結(jié)構(gòu)。VP4被包埋在病毒粒子外殼的內(nèi)側(cè)與病毒核心緊密連接，其它三種結(jié)構(gòu)蛋白均暴露在病毒顆粒的表面［6，7］。

2 新型HFMD藥物的研究策略

目前新型藥物研發(fā)主要基于以下兩個(gè)方面：(1)針對病毒復(fù)制循環(huán)中的某個(gè)特定步驟及分子靶標(biāo)，研發(fā)特異性、高效的新型先導(dǎo)化合物。包括：病毒吸附及脫殼，病毒蛋白翻譯、多聚蛋白剪切、病毒RNA復(fù)制、病毒組裝等;(2)對現(xiàn)有抗病毒復(fù)合物的修飾，以期達(dá)到更好的抗病毒效果。

2.1 基于病毒殼體蛋白的藥物研發(fā)

研發(fā)思路主要是：設(shè)計(jì)化合物、與病毒殼體蛋白VP1中心的疏水性口袋結(jié)合，阻礙病毒吸附或脫殼過程，進(jìn)而抑制病毒復(fù)制。普來可那立(Pleconaril)可顯著減少腸道病毒引發(fā)的細(xì)胞病變，不僅對腸道病毒原型株有效，對215例臨床分離株也表現(xiàn)出很強(qiáng)的效應(yīng)，臨床實(shí)驗(yàn)表明Pleconari可顯著減少感冒患者的持續(xù)時(shí)間和嚴(yán)重程度。但Pleconari對EV71無明顯抑制效果，該藥用于感冒治療的申請未通過FDA的批準(zhǔn)。目前，正在探討Pleconari鼻腔噴霧劑在腸病毒感染引發(fā)的感冒及哮喘中的治療效果，相關(guān)Ⅱ臨床研究已經(jīng)完成［2］。

基于瞇唑啉酮的骨架結(jié)構(gòu)，以Pleconari為模板，利用計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)的方法，最新研發(fā)了一系列瞇唑啉酮吡啶基化衍生物，這些衍生物對EV71等腸道病毒表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗病毒效果。研究發(fā)現(xiàn)一類衍生物1-［5(40-溴苯)戊基］-3-(4-吡啶)-2-瞇唑啉酮(BPR0Z-194)抗EV71病毒效果明顯，以VP1蛋白作為分子靶標(biāo)，VP1蛋白192位的纈氨酸突變?yōu)榧琢虬彼峥墒共《颈憩F(xiàn)出對BPR0Z-194的耐受性，表明以病毒殼體蛋白為靶點(diǎn)研發(fā)的這類化合物的抗病毒活性與其結(jié)合到VP1疏水性口袋的能力息息相關(guān)［8］。

2.2 以病毒RNA復(fù)制為靶點(diǎn)的藥物設(shè)計(jì)

腸道病毒RNA復(fù)制過程涉及很多病毒蛋白，包括2B、2C、3A、3D等，這些蛋白已成為藥物研發(fā)的新分子靶點(diǎn)。

3A蛋白構(gòu)成病毒RNA復(fù)制機(jī)的骨架結(jié)構(gòu)，在腸病毒科中高度保守，恩韋肟［2-氨基-1-(異丙基磺酰)-6-苯并咪唑二苯(甲)酮肟］是一類苯并咪唑衍生物，體外實(shí)驗(yàn)研究表明可有效抑制腸道病毒，對11種EV70及15種CoxA24臨床分離株的50%CPE(細(xì)胞病變效應(yīng))抑制濃度 (ID50)為0.01～0.65 mg/L。目前正對恩韋肟進(jìn)行進(jìn)一步的乙烯乙炔化和C2化，以期產(chǎn)生具有更好生物利用度和藥理學(xué)效應(yīng)的衍生物，實(shí)驗(yàn)表明乙烯乙炔化的恩韋肟衍生物12經(jīng)口服途徑給藥，對CoxA21感染的小鼠具有非常有效的治療效果［9］。

3D RNA聚合酶是藥物研發(fā)的另一重要靶點(diǎn)。核苷類似物通過增強(qiáng)RNA病毒的突變頻率導(dǎo)致病毒錯(cuò)誤突變、降低病毒存活率。利巴韋林(ribavirin)就是其中一類核苷類抗病毒藥，抑制病毒的RNA復(fù)制作用，目前在臨床上已廣泛應(yīng)用于手足口病的治療［10］，但該藥可致白細(xì)胞減少和貧血，大劑量應(yīng)用可損害心肌，對有呼吸道疾病(慢性阻塞性肺疾病或哮喘)患者可致呼吸困難、胸痛等不良反應(yīng)。目前正在對利巴韋林、胞二磷膽堿、嘌呤類似物等核苷類似物進(jìn)行進(jìn)一步修飾，Harki DA等合成的5-取代胞二磷膽堿衍生物具有強(qiáng)于利巴韋林的抗病毒效果。除了核苷類似物，其他以RNA聚合酶為靶點(diǎn)的新型抑制劑也在不斷研發(fā)中，鹽酸阿米洛利通過阻礙細(xì)胞鐵轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)、抑制柯薩奇病毒RNA的復(fù)制［9］;吡唑并［3，4-d］嘧啶是一類新型的EV71抑制劑，以EV71病毒的RNA聚合酶為藥物分子靶點(diǎn)，并對其他腸道病毒具有廣譜的抗病毒效果［11］。

2.3 以病毒蛋白酶為靶點(diǎn)的藥物研發(fā)

病毒蛋白酶2A和3C參與腸道病毒多蛋白加工，是抗病毒藥物設(shè)計(jì)的良好靶點(diǎn)。目前針對3C蛋白酶靶點(diǎn)的藥物研發(fā)思路主要包含多肽類及非多肽類蛋白酶抑制劑兩個(gè)方面。多肽類抑制劑方面可通過對3C蛋白酶底物進(jìn)行修飾，以增強(qiáng)3C蛋白酶抑制劑的抗病毒活性。將3C蛋白酶抑制劑上的酰胺羰基基團(tuán)替換為吸電子基團(tuán)Michael受體，可造成3C蛋白酶與其抑制劑之間不可逆的共價(jià)結(jié)合，從而大大增強(qiáng)抗病毒活性。蘆平曲韋(AG7088)就是其中一類修飾后的抑制劑，對柯薩奇病毒A21、柯薩奇病毒B3、EV70等腸道病毒都具有非常強(qiáng)的抗病毒活性，在腸道病毒感染患者的治療方面已有成功的案例［12］，但蘆平曲韋不能降低病毒滴度，相關(guān)臨床實(shí)驗(yàn)已經(jīng)終止。目前，高通量細(xì)胞水平上的EV71 3C蛋白酶抑制劑篩選平臺已經(jīng)建立，將大大加快藥物研發(fā)的腳步。

此外，針對在病毒翻譯、RNA合成中發(fā)揮重要作用的RNA 5'非翻譯區(qū)也研發(fā)了一些先導(dǎo)化合物。反義的磷硫酰DNA對柯薩奇病毒B3(CoxB3)具有較強(qiáng)的抑制作用;多肽類磷硫酰嗎啉代聚合物(PMOs)EnteroX以5'非翻譯區(qū)的內(nèi)核糖體進(jìn)入位點(diǎn)為靶點(diǎn)，對臨床柯薩奇病毒B2(CoxB2)分離株具有良好的抗病毒效果［13］。

3 討論

目前手足口病抗病毒藥物研發(fā)已經(jīng)取得了可喜的進(jìn)展，但尚無藥物經(jīng)過FDA批準(zhǔn)，新型特異性藥物的成功開發(fā)還需要一段很長的路。伴隨著系統(tǒng)生物學(xué)、藥物蛋白質(zhì)組學(xué)等生物醫(yī)藥領(lǐng)域的迅猛發(fā)展，EV71等腸道病毒基因組結(jié)構(gòu)的詳細(xì)闡釋、病毒蛋白三級結(jié)構(gòu)(如3C蛋白水解酶晶體結(jié)構(gòu)［7］)的不斷揭示為新型抗病毒藥物的研發(fā)提供了更多的特異性、安全性的藥物分子靶標(biāo)，勢必會(huì)推動(dòng)藥物開發(fā)的進(jìn)程。此外系統(tǒng)性的審視手足口病疾病模型，多角度、多靶點(diǎn)的進(jìn)行藥物研發(fā)，各靶點(diǎn)協(xié)同效應(yīng)可達(dá)到最佳的抗病毒效果。

在此基礎(chǔ)上，更好的利用計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)的方法，借助計(jì)算機(jī)更好的進(jìn)行多學(xué)科前沿領(lǐng)域的交叉、輔助設(shè)計(jì)技術(shù)與合理藥物設(shè)計(jì)過程，將節(jié)省新藥研發(fā)工作的人力、物力、財(cái)力，大大加快研制新藥的速度［14］。

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210009 中國藥科大學(xué)藥學(xué)院(崔穎);諸城市人民醫(yī)院藥劑科(崔向陽)