低氧對神經干細胞增殖及分化的影響

杜 娟， 陳 立， 陳 麗綜述， 呂曉紅審校

神經干細胞(neural stem cells，NSCs)是近年來治療神經系統疾病頗具前景的基因工程細胞，尤其是在神經功能修復方面，具有重要的科學意義及社會應用價值。對于神經功能損傷的治療，目前僅限于內科藥物治療及外科手術干預，但對于已經喪失的神經功能的恢復和重建，這些治療措施都無根本性療效。而神經干細胞的研究和發展為解決這一問題提供了重要的途徑和手段，成為研究的熱點。但神經干細胞移植目前仍處于動物實驗階段，究竟是什么制約這一研究的進展呢?眾所周知，神經干細胞首先要在移植體內存活，才能發揮作用。大量的動物實驗表明，在被移植入損傷區后，神經干細胞的存活、增殖、分化以及遷徙過程均受到局部復雜微環境等因素的影響，特別是腦血管疾病中缺血缺氧的局部微環境，這是制約干細胞移植的瓶頸之一。隨著對這些問題認識的不斷深入和研究的不斷進展，到目前為止的證據表明干細胞療法的繼續發展，最終可能成為缺血性腦損傷可行的治療選擇。

1 氧濃度是神經干細胞微環境中的重要組分

自我更新和多能性是干細胞的特性，而這種特性與干細胞所處環境中各種因素的平衡密切相關，該環境稱為微環境，早在1978年Schofield就提出了這一概念，即細胞、細胞間質及影響細胞生長的各種因素組成的復雜而統一的環境，微環境中的任何因素發生變化，都會轉化成一定的信號進而影響細胞。其中包括傳統認識中的培養基成分、營養因子、pH、氧濃度等，特別是氧氣濃度成為一直以來研究的熱點，被認為是微環境中非常重要的因素。以往認為細胞生存所需氧濃度與大氣中氧濃度(21%，160mmHg)相同，但在生物體內并非如此，氧氣從被吸入肺部然后隨血液運送至全身，到達器官和組織時其濃度和壓力已非常低(2% ～9%，14～65 mmHg)。近年來研究亦顯示，體內多種組織特別是含有干細胞的組織中氧濃度遠遠低于大氣氧濃度，而微環境中的這種低氧狀態不管對胚胎干細胞還是成體干細胞的生物學行為影響都非常巨大［1］。如骨髓間充質干細胞所處的微環境便是一種低氧環境，氧濃度約為1% ～7%。體外實驗表明，低氧可以使干細胞的細胞周期減慢，分化減少。1%氧濃度下較21%氧濃度下，間充質干細胞發生了各方面的變化。細胞在形態上表現出體積增大;細胞的增殖明顯減少并且大部分停止在G1期［2］。另有研究表明，低氧在骨髓造血干細胞和間充質干細胞的增殖和成熟過程中起重要作用。且低氧持續時間是細胞分化潛能的一個鑒定指標。在更接近于生理條件的缺氧環境中持續培養的研究顯示，與常氧濃度下培養相比，在5%氧濃度下，細胞的分化減少，其干細胞特性保持的更強，這可能暗示體內的低氧環境可以使更多的干細胞處于靜息狀態［3］。對于神經母細胞瘤細胞，間歇性低氧可以增強其類似干細胞的特性，并抑制其分化傾向，這似乎從另一方面證明了氧濃度對干細胞的作用［4］。

神經干細胞是干細胞的一種，具有自我更新、增殖及分化成星形膠質細胞、少突膠質細胞和神經元的能力。在成體，神經干細胞主要存在于側腦室室管膜下層(subventricular zone，SVZ)和海馬齒狀回顆粒下層(subgranular zone，SGZ)，這是目前公認的兩個神經發生區域。有研究顯示小鼠的腦組織中氧分壓亦遠低于大氣，中腦處約為0.55%，大腦皮質處約為8%，神經干細胞亦處于一種相對低氧的特殊微環境中，推測該微環境中氧濃度約為2.5% ～3%［5］。生理狀態下的這種低氧會減慢細胞周期和抑制分化，可能對神經干細胞保持一種未分化的類似“休眠”的穩定狀態有一定作用［6］，體外研究也證實了這一點。在缺血缺氧性腦卒中事件中，神經干細胞所處的微環境更為特殊，其中的氧濃度較生理狀態更低，但研究顯示，在大腦中動脈閉塞引起局灶性腦缺血缺氧部位移植神經干/祖細胞，不但神經干細胞自身的存活能力及增殖分化能力提高，而且可以減少局部神經元的凋亡，這個過程主要由缺氧誘導因子1α(hypoxia-inducible factor-1alpha，HIF-1α)-血 管 內 皮 生 長 因 子 (Vascular endothelial growth factors，VEGF)信號途徑(HIF-1α-VEGF)介導［7］。因此，氧濃度是神經干細胞生存微環境中重要的組成部分，低氧能夠增強神經干細胞自身的增殖和成熟過程，同時神經干細胞通過一系列的變化也影響其所處的微環境。

2 低氧影響神經干細胞的增殖和分化

在體內環境中，從胚胎形成到圍產期以及成人的神經發育過程中，神經干細胞所處的氧濃度是不斷變化的。如前所述，神經干細胞在成體內多數情況下處于一種類似“休眠”的狀態，但受到各種生理或病理性刺激時，神經干細胞就會進入增殖及分化階段。而缺血性腦卒中是重要的刺激因素之一，Ohira等人發現，缺血性損傷會激活新大腦皮質的神經干細胞和神經祖細胞，并促進其增殖和分化［8］。在發生缺血性腦卒中的腦組織局部會形成特殊的血管微環境，而血管周圍相對的缺血缺氧狀態是影響神經干細胞生物學行為的主要因素。在缺血缺氧性腦卒中事件中，大腦會出現自身的修復，并且存在新的神經元的發生。最新研究表明，神經干細胞會向缺血缺氧的腦組織區域募集，趨化因子CCL2及其受體CCR2在此過程中起關鍵作用［9］。被募集到缺血缺氧的腦組織區域的神經干細胞的存活及增殖能力都大大提高，并且通過間質衍生因子-1和血管生成素-1與血管的重建和再生產生密切關聯。

在體外培養條件下，氧濃度對神經干細胞增殖和分化的影響顯得更為突出。早在2000年，Studer等人就提出了氧濃度對神經干細胞的生物學作用，他們通過對比常氧(152mmHg)和低氧(22.8±15.2mmHg)環境下鼠胚胎神經祖細胞的培養發現，低氧濃度促進細胞的增殖，同時減少了細胞的凋亡;另外，神經祖細胞向神經元的分化亦受影響，在低氧濃度下，多巴胺能神經元比率上升到56%，而常氧濃度下其比率僅為18%［10］。而最近研究顯示，在低氧濃度下(2%O2)，胚胎干細胞在早期會出現一定程度的分化，且主要為神經祖細胞的分化。這個過程主要靠成纖維細胞生長因子4(fibroblast growth factor，FGF4)/細胞外信號調節蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinases，ERK)的自分泌和糖原合酶激酶-3(glycogen synthase kinase-3，GSK-3)信號通路調節［11］。因此，氧氣在神經系統的發生及形成過程中均扮演著重要的角色。Morrison等也提出在低氧濃度下(38mmHg)神經嵴干細胞的存活率、增殖率及兒茶酚胺類神經元的分化率均提高［12］。另有研究表明，源于孕15～16d的美國癌癥研究所小鼠(institute of cancer researcch，ICR)胚胎的神經干細胞在15.2mmHg的氧濃度下表現出最強的增殖及分化能力［13］。低氧和抗氧化劑也可增加來源于腸神經系統的神經干細胞的增殖。而來源于人類胚胎干細胞的神經干細胞，在3%氧濃度下與常氧濃度下相比其存活率亦增加，且在特定趨化因子作用下，可以向脊髓運動神經元、多巴胺神經元、運動神經元前體細胞特定分化［14］。因此，在體外培養條件下，氧濃度會促進神經干細胞的增殖，對其分化方向也有一定誘導作用，且主要向多巴胺能神經元分化。在體內及體外條件下，氧濃度對神經干細胞的調節主要涉及以下幾個機制。

2.1 細胞因子及相關信號途徑 HIF-1是氧濃度對神經干細胞增殖及分化調節過程中重要的細胞因子，有α和β兩個亞基。HIF-1α是調節細胞缺氧適應過程中重要的轉錄激活因子，在多數細胞和組織中，其含量很低，在胞質內處于失活狀態;但是在缺氧條件下其含量則升高，可被激活并轉移到細胞核并與HIF-1β形成HIF-1分子，識別并結合包含有低氧反應元件的DNA序列。

在缺血性神經系統疾病中，HIF-1α在神經祖細胞的存活及替代缺血壞死神經細胞的過程中起重要作用。HIF-1α通過對細胞新陳代謝、血管再生的直接轉錄調節來完成機體對缺氧的適應［15］。在胚胎干細胞中HIF-1α主要是通過提高β-連環蛋白(β-catenin)的活性及下游效應器淋巴增強因子-1(lymphoid enhancer factor-1，LEF-1)和 T細胞因子 1(Tcellfactor4，TCF-4)的表達來調節Wnt/β-catenin信號通路。這種調節在神經干細胞中也是存在的，但是在已分化的細胞中未發現［16］。另有研究表明，在成年腦組織的神經發生區域、神經干/祖細胞、出生后的小鼠腦組織中，HIF-1α持續表達。在正常情況下的神經干/祖細胞中，HIF-1α不會發生典型的羥基化、泛素化及退化。HIF-1α主要存在于細胞質的膜結構中，免疫電子顯微鏡證實了含有HIF-1α的囊泡，這種結構可能防止HIF-1α的退化。而經過HIF-1α相關基因敲除的神經干/祖細胞對缺氧的耐受性降低，且Notch-1和β-catenin的表達水平發生顯著的變化，而這些分子與缺氧耐受存在密切關系［17］。

Wnt/β-catenin信號通路是調控細胞增殖的關鍵通路，在低氧促進神經干細胞增殖過程中也起著重要作用。研究顯示，在利用缺氧(5%O2)環境促進海馬神經干細胞增殖過程中，Wnt/β-catenin信號途徑起關鍵作用，β-catenin是其中主要的蛋白［18］。在體內，Wnt/β-catenin信號通路的活性與SGZ密切相關，而該處亦是神經干細胞發生的主要區域。HIF-1α缺失會使Wnt/β-catenin信號通路受抑制，從而使干細胞的增殖、分化及成熟受累［16］。

另外，缺氧促進神經祖細胞的增殖和分化，此過程中促紅細胞生成素(erythropoietin，EPO)促進了細胞的分化，減少了細胞的凋亡。缺氧特異性的粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子過度表達有利于移植神經干細胞存活和神經功能的改善［19］。而EPO聯合粒細胞集落刺激因子能夠促進缺血缺氧動物模型神經功能的恢復，其機制包括增強抗細胞凋亡蛋白bcl-2的表達，增強神經營養因子的合成和促進新生血管再生［20］。也有研究顯示，缺氧誘導的VEGF基因表達系統能夠調節神經干細胞的存活力。表達缺氧特異性VEGF的神經干細胞應用于脊髓損傷模型中，可以提高移植細胞的存活率及促進血管再生，同時抑制不需要的細胞及血管的增生［21］。

2.2 基因水平改變 基因水平改變其實是細胞因子及相關信號通路調節過程中的一個關鍵環節，它們相互促進，不可分割。當然這個過程中也會存在一些特殊的變化。研究表明，非編碼微小 RNA(non coding RNA，ncRNA)在神經發育、細胞存活等過程中扮演關鍵角色。在缺氧條件下，ncRNAs參與細胞增殖的調節過程，有15種微小RNA(microRNA，miR)的水平上調，11種下調，其中miR-210上調明顯。進一步研究表明 HIF-1α對miR-210有直接影響作用［22］。在基因修復方面，核酸內切酶Neil3可以通過準確的DNA分子修復使神經干細胞避免遭受缺血缺氧損傷，而Neil 3缺陷的神經干細胞不能完成向神經祖細胞的增殖和單鏈DNA氧化應激的修復［23］。另外，反轉錄酶-聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)分析顯示表達細胞間黏附分子的mRNA水平亦發生改變，其中最明顯的是表達基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)的mRNA。在1%氧濃度下，抑制MMP-9的活性，細胞的增殖和遷移會降低，而且，通過Wnt通路拮抗劑DKK-1(dikkopf-1)抑制HIF-1α介導的經典Wnt信號通路時，細胞的增殖降低，MMP-9表達也減少。因此，MMP-9亦是低氧濃度促進干細胞增殖機制中的關鍵分子之一［24］。

2.3 代謝水平的變化 能量代謝中的相關分子和信號途徑影響神經干細胞的功能，包括胰島素生長因子(insulin growth factor 1，IGF-1)-轉錄因子FoxO和IGF-1-雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號途徑、腺苷酸活化蛋白激酶、沉默信息調節因子(silentmating type information regulation 2 homolog1，SIRT1)和HIF。在低氧(3%O2)條件下，培養基中葡萄糖含量降低，而丙酮酸、乳酸含量升高，說明在低氧環境下，神經祖細胞主要靠糖酵解獲取能量。而這一過程中，通過對基因分析檢測發現，1.24%的基因表達發生變化，其中絕大多數涉及糖酵解途徑［25］。另外，在體外缺氧誘導神經干細胞的增殖過程中，代謝型谷氨酸受體亞型5(metabotropic glutamate receptor 5 subtype，mGluR5) 的表達有增高。在此過程中胞外信號調節激酶(extracellular signal regulated kinase，ERK)和氨基末端激酶(Jun N-terminal kinase，JNK)信號通路及細胞周期蛋白 D1的表達增加。這些結果還表明mGluR5參與神經干細胞增殖，并且為中樞神經系統缺血/缺氧損傷后的神經功能修復提供了一個目標分子［26］。

3 缺氧預處理提高神經干細胞對抗缺血缺氧的能力

低氧預適應是機體的一種重要的內源性保護機制，而缺氧預處理對于神經干細胞是否亦存在同樣的保護作用呢?如前所述，人類胚胎干細胞(human embryonic stem cells，hESCs)移植是治療缺血性卒中頗具潛力的治療方法，但是宿主的內環境阻礙了此技術的發展。最近研究表明經缺氧預處理的ESCs適應能力增強。將來源于hESCs的神經球在0.1%氧濃度下培養12h，然后在21%氧繼續培養分化，免疫組織化學及電生理檢查證明預處理能增強細胞分化。且這種神經保護作用至少持續5d，具有神經保護作用的蛋白質的表達也相應上調［27］。缺氧預處理增強干細胞對抗缺血缺氧能力的同時，對于移植細胞和宿主細胞的存活率都能提高。缺氧預處理的脂肪來源的間充質干細胞與未經缺氧預處理的相比，形態學沒有發生明顯的變化，且這種經缺氧預處理干細胞與神經干細胞共同移植時，能夠提高神經干細胞的存活率，減少凋亡因子Bax的表達［28］。缺氧預處理增強神經干細胞對抗缺血缺氧能力的機制尚不十分明確，研究表明，缺氧預處理后免疫印跡顯示HIF-1α和HIF-2α的表達增強，同時引起了一系列相互促進的反應，包括EPO、VEGF和 Bcl 2家族成員［27］。另有研究表明，在鼠神經干細胞的缺氧預適應中涉及到Xc系統(胱氨酸和谷氨酸跨膜轉運的跨膜蛋白)，并證明該蛋白與缺氧預適應的神經保護作用有關［29］。縫隙連接在缺氧預處理過程中亦發生變化，縫隙連接是宿主細胞和被移植的神經干細胞之間重要的結構，它對細胞的功能及細胞之間的相互作用非常重要。在中樞神經系統缺血缺氧性疾病中，縫隙連接會增多。此研究顯示，缺氧預處理，會使連接蛋白43(connexin 43，Cx43)的表達增高，宿主和移植物之間的信息流通提高。本研究顯示，對神經干細胞進行3h的缺氧預處理，會使Cx43的表達提高31%［30］。

4 展望

氧濃度對神經干細胞增殖和分化的研究使得干細胞學科更加完善和深入，并且必將推動神經干細胞移植治療的進一步發展，尤其是在缺血缺氧性腦卒中中的應用與研究。雖然低氧條件下的神經干細胞培養實驗已取得一定進展，但仍存在很多的未知，這需要我們進一步的研究。

［1］Eliasson P，Jonsson JI.The hematopoietic stem cell niche:low in oxygen but a nice place to be［J］.Cell Physiol，2010，222:17-22.

［2］Holzwarth C，Vaegler M，Gieseke F，etal.Low physiologic oxygen tensions reduce proliferation and differentiation of human multipotent mesenchymal stromal cells［J］.BMC Cell Biol，2010，11:11.

［3］Basciano L，Nemos C，Foliguet B，etal.Long term culture ofmesenchymal stem cells in hypoxia promotes a genetic program maintaining their undifferentiated and multipotent status［J］.BMC Cell Biol，2011，12:12.

［4］Bhaskara VK，Mohanam I，Rao JS，etal.Intermittenthypoxia regulates stem-like characteristics and differentiation of neuroblastoma cells［J］.PLoSOne，2012，7(2):e30905.

［5］Santilli G，Lamorte G，Carlessi L，etal.Mild hypoxia enhances proliferation and multipotency of human neural stem cells［J］.PloS one，2010，5:e8575.

［6］Koning M，Werker PM，van Luyn MJ，etal.Hypoxia promotes proliferation of humanmyogenic satellite cells:a potential benefactor in tissue engineering of skeletalmuscle［J］.Tissue Eng Part A，2011，17(13 ～14):1747-1758.

［7］Harms KM，Li L，Cunningham LA.Murine neural stem/progenitor cells protectneurons against ischemia by HIF-1alpha-regulated VEGF signaling［J］.PLoSONE，2010，5(3):e9767.

［8］Ohira K，Furuta T，Hioki H，etal.Ischemia-induced neurogenesis of neocortical layer 1 progenitor cells［J］.Nat Neurosci，2010，13，173-179.

［9］Andres RH，Choi R，Pendharkar AV，etal.The CCR2/CCL2 interaction mediates the transendothelial recruitment of intravascularly delivered neural stem cells to the ischemic brain［J］.Stroke，2011，42(10):2923-2931.

［10］Studer L，Csete M，SangHun L，etal.Enhanced proliferation，survival，and dopaminergic differentiation of CNSprecursors in lowered oxygen［J］.Neurosci，2000，20:7377-7383.

［11］Fernandes TG，Diogo MM，Fernandes-Platzgummer A，etal.Different stages of pluripotency determine distinct patterns of proliferation，metabolism，and lineage commitment of embryonic stem cells under hypoxia［J］.Stem Cell Res，2010，5(1):76-89.

［12］Morrison SJ，Csete M，Groves A，etal.Culture in reduced levels of oxygen promotes clonogenic sympathoadrenal differentiation by isolated neural crest stem cells［J］.Neurosci，2000，19:7370-7376.

［13］Horie N，So K，Moriya T，etal.Effects of oxygen concentration on the proliferation and differentiation of mouse neural stem cells in vitro［J］.Cell Mol Neurobiol，2008，28:833-845.

［14］Stacpoole SR，Bilican B，Webber DJ，etal.Efficient derivation of NPCs，spinalmotor neurons and midbrain dopaminergic neurons from hESCs at3%oxygen［J］.Nat Protoc，2011，6(8):1229-1240.

［15］Cunningham LA，Candelario K，Li L.Roles for HIF-1α in neural stem cell function and the regenerative response to stroke［J］.Behav Brain Res，2012，227(2):410-417.

［16］Mazumdar J，O＇Brien WT，Johnson RS，etal.O2regulates stem cells through Wnt/β-catenin signalling［J］.Nat Cell Biol，2010，12(10):1007-1013.

［17］Roitbak T，Surviladze Z，Cunningham LA.Continuous expression of HIF-1α in neural stem/progenitor cells［J］.Cell Mol Neurobiol，2011，31(1):119-133.

［18］Cui XP，Xing Y，Chen JM，etal.Wnt/beta-catenin is involved in the proliferation of hippocampal neural stem cells induced by hypoxia［J］.Ir JMed Sci，2011，180(2):387-393.

［19］Kim HJ，Oh JS，An SS，etal.Hypoxia-specific GM-CSF-overexpressing neural stem cells improve graft survivaland functional recovery in spinal cord injury［J］.Gene Ther，2011，10:1038.

［20］Liu SP，Lee SD，Lee HT，etal.Granulocyte colony-stimulating factor activating HIF-1alpha acts synergistically with erythropoietin to promote tissue plasticity［J］.PLoSOne，2010，5(4):e10093.

［21］Oh JS，An SS，Gwak SJ，etal.Hypoxia-specific VEGF-expressing neural stem cells in spinal cord injury model［J］.Neuroreport，2012，23(3):174-178.

［22］Liu ZH，Yang G，Zhao T，etal.Small ncRNA expression and regulation under hypoxia in neural progenitor cells［J］.Cell Mol Neurobiol，2011，31(1):1-5.

［23］Sejersted Y，Hildrestrand GA，Kunke D，etal.Endonuclease VIII-like 3(Neil3)DNA glycosylase promotes neurogenesis induced by hypoxia-ischemia［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2011，108(46):18802-18807.

［24］Ingraham CA，Park GC，Makarenkova HP，etal.Matrixmetalloproteinase(MMP)-9 induced by Wnt signaling increases the proliferation and migration of embryonic neural stem cells at low O2levels［J］.Biol Chem，2011，286(20):17649-17657.

［25］Zhu LL，Zhao T，Huang X，etal.Gene expression profiles and metabolic changes in embryonic neural progenitor cells under low oxygen［J］.Cell Reprogram，2011，13(2):113-120.

［26］Watmuff B，Pouton CW，Haynes JM.In vitromaturation of dopaminergic neurons derived from mouse embryonic stem cells:implications for transplantation［J］.PLoSOne，2012，7(2):e31999.

［27］Francis KR，Wei L.Human embryonic stem cell neural differentiation and enhanced cell survival promoted by hypoxic preconditioning［J］.Cell Death Dis，2010，1:e22.

［28］Oh Js，Ha Y，An SS，etal.Hypoxia-preconditioned adipose tissue-derived mesenchymal stem cell increase the survival and gene expression of engineered neural stem cells in a spinal cord injury model［J］.Neurosci Lett，2010，472(3):215-219.

［29］Sims B，Clarke M，Francillion L，etal.Hypoxic preconditioning involves system Xc-regulation in mouse neural stem cells［J］.Stem Cell Res，2012，8(2):285-291.

［30］Juderstad J，Brismar H，Herlenius E.Hypoxic preconditioning increases gap-junctional graft and host communication［J］.Neuroreport，2010，21(17):1126-1132.