高效液相色譜在高血壓診斷中的應用進展

梁瑞峰，王 軍

(河南省中醫藥研究院中藥研究所藥理實驗室，河南鄭州450004)

高血壓一般分為原發性高血壓和繼發性高血壓兩種，其中原發性高血壓約占95%以上［1］，據估計全球約有10億高血壓病患者，且患病率總體呈明顯上升趨勢。高血壓具有患病率高、致殘率高、死亡率高和知曉率低、服藥率低、控制率低的特點。因此對其進行有效防治已成為世界范圍內共同關注的公共衛生問題。高效液相色譜(HPLC)技術具有適用范圍廣、選擇性強、分析速度快、靈敏度高、樣品用量少等優點，在藥物和臨床樣品檢驗分析中已被廣泛應用。本文就高效液相色譜技術在高血壓診斷中的應用文獻進行綜述。

1 兒茶酚胺類物質的HPLC檢測

兒茶酚胺是腎上腺素(epinephrine，E)、去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)及多巴胺(dopamine，DA)的總稱，主要由交感神經和腎上腺髓質產生和釋放。腎上腺髓質主要產生腎上腺素和少量的去甲腎上腺素，交感神經主要分泌去甲腎上腺素。兩者在單胺氧化酶(MAO)和兒茶酚胺O－甲基轉換酶(COMT)作用下通過2種不同代謝途徑最終生成3－甲氧－4－羥苦杏仁酸(VMA)，與葡萄糖醛酸或硫酸結合成酯類從尿中排出，在病理情況下，特別是嗜鉻組織的腫瘤，分泌產生大量腎上腺素和去甲腎上腺素，引起血壓升高。測定其血漿濃度可為高血壓病的鑒別診斷提供依據［2－4］。高效液相色譜法因其高分離效率而廣泛應用于兒茶酚胺類物質的分析檢測，其中，以HPLC與電化學分析法(ECD)相結合的方法最為常用。近年來，HPLC同質譜(MS)和熒光檢測法(FL)的聯用也逐漸發展起來。

1.1 HPLC－ECD

國內外有很多采用HPLC－ECD檢測兒茶酚胺類物質的報道，分別檢測了組織樣品［5］、血漿樣品中的兒茶酚胺類物質［6］。Sabbioni等［7］通過對HPLC－ECD中的庫侖法和安培法2種檢測方法進行對比，發現2者均有很好的線性、提取率和精密度，但庫侖檢測法在靈敏度、選擇性和抗干擾方面明顯優于安培檢測法。為了在相對短的時間內獲得較好的分離，對色譜參數(如色譜柱型號、流動相、平衡時間)進行了研究，最后選擇 C8柱，流動相為 pH 3.5、甲醇含量為50 g/L的水溶液，平衡時間至少4 h。

1.2 HPLC－MS

HPLC－MS檢測兒茶酚胺類物質可提供有用的結構信息，比普通的紫外檢測有更好的選擇性。Kushnir等［8］采用HPLC結合電噴霧串聯質譜(ESI－MS/MS)分析尿中的兒茶酚胺類物質，采用兩步液液萃取法處理樣品，用多反應監測模式(MRM)來定性E、NE和DA，選擇的監測離子對E為m/z184/107和184/77、NE為m/z170/107和170/77、DA為m/z 154/91和154/65。此法對含兒茶酚基團的化合物有一定的特異性，能排除藥物及其代謝物的干擾。

1.3 HPLC－FL

HPLC－FL用于分析人血漿中的兒茶酚胺類物質，其原理是因為兒茶酚胺類物質本身有自然熒光，所以樣品經Al2O3處理后可直接進行熒光檢測［9］。但由于自然熒光相對較弱，一般需采用衍生化來提高檢測靈敏度，采用的衍生化方法主要為柱后衍生化和柱前衍生化。

2 非對稱性二甲基精氨酸的HPLC檢測

一氧化氮(nitric oxide，NO)是機體內重要的血管舒張因子，可以調節血管收縮張力，并通過抑制平滑肌細胞收縮和血小板的聚集影響血液循環，在舒張血管及調節血壓等方面起著十分重要的作用。NO是由一氧化氮合酶(nitric oxide synthosis，NOS)以1－精氨酸及氧分子為底物催化合成的，在NO前體充分存在的情況下，NO的合成主要受細胞內NOS的調節。因此，NOS的含量及活性的變化是影響NO合成的重要因素。近年來的研究表明，機體內存在著一種調節NO合成的內源性機制，即1－精氨酸的同類物非對稱性二甲基精氨酸(asymmetrica1 dimethy1arginine，ADMA)與NOS結合，競爭性抑制NO的合成。ADMA是一分子量為202 D的小分子物質，廣泛存于人的血漿、尿液及血管內皮細胞中［10］。高血壓患者血清ADMA濃度明顯升高，尿ADMA濃度降低，血清ADMA濃度與收縮壓及舒張壓呈正相關。健康人血漿ADMA水平為(0.42±0.06)μmol/L，在無癥狀的高膽固醇血癥年輕患者，血漿ADMA水平升高到(2.2± 0.2)μmol/L。有學者采用HPLC層析法檢測ADMA:取血清樣本，沉淀劑沉淀，取上清液加鄰苯二甲醛(OPA)柱前衍生，用同溶劑反相HPLC分離，以熒光檢測器分析［11－12］，但OPA熒光產物不穩定，影響了控制分析結果的重現性和靈敏度。張和順等［13］用一種新的衍生試劑萘－2，3－二羧基醛，并改進原有色譜條件，建立了一種操作簡便、穩定、靈敏度高、重復性好的檢測人血漿中ADMA濃度的方法。王洪巨等［14］用高效液相色譜聯合質譜(HPLC－MS)的方法測定人血漿中的ADMA濃度，方法更加靈敏。

3 同型半胱氨酸的HPLC檢測

同型半胱氨酸(Homocystine，Hcy)是蛋氨酸分解代謝過程中產生的一種含硫氨基酸。血漿Hcy包括還原型Hcy、雙硫Hcy、混合雙硫半胱氨酸－Hcy和混合雙硫蛋白質－Hcy。正常情況下游離Hey很少，主要以蛋白質形式存在。Hcy主要通過再甲基化和轉硫2條途徑進行代謝。近年來，許多流行病學和臨床研究發現，由Hcy代謝異常導致的高同型半胱氨酸血癥是引起高血壓的主要危險因素，因此在高血壓及心腦血管疾病患者中定期進行血漿Hcy檢測，是心腦血管疾病診斷最獨特、最有效的預測指標之一［15］。正常情況下血漿同型半胱氨酸含量甚微，人體血中的Hcy水平在10μmol/L以上稱為高同型半胱氨酸血癥或血漿同型半胱氨酸水平升高［16］。1項6個城市研究中心的數據顯示，我國成年高血壓患者中伴有高Hcy者約占75%(男性占91%，女性占60%)，伴有高Hcy的原發性高血壓，定義為“H型”高血壓［17］。過去由于測定技術的難度，曾一度認為血漿內不含同型半胱氨酸。1985年Resum等最先建立了同位素測定Hcy方法，1987年Stabier報道了氣相色譜檢測法。目前應用最廣泛的是高效液相色譜法，根據檢測方法的不同，可分為熒光法和電化學法。

3.1 HPLC－FL

血漿中同型半胱氨酸經三丁基磷還原后與巰基特異結合的熒光物質SBD－F進行衍化反應形成帶有共軛結構的化合物，受紫外光激發后，能輻射出熒光，在一定條件下，熒光強度和樣品的濃度成正比。此外，因其形成的不同化合物結構和極性的不同，在色譜中的保留時間存在差異，因此可利用HPLC－FL檢測出血漿中的Hcy的濃度。一般情況下，同型半胱氨酸濃度在0～45μmol/L范圍內與絕對峰面積比呈線性關系，回收率為92.13%～108.04%。HPLC－FL測定血漿Hcy的方法具有靈敏度高、穩定性及重復性好等優點。

3.2 HPLC－ECD

HPLC－ECD具有樣本處理簡單、無需衍生等特點，且有較高的靈敏性、專一性和穩定性，應用較為廣泛。但由于電化學檢測器工作電極表面易被氧化還原反應產物污染，易出現被檢測物響應降低的現象。因此，檢測前可先用6 mmol/L的硝酸清洗流動池、電化學檢測器采用脈沖方式沖洗工作電極或用重鉻酸鉀洗液浸泡1 min等方法，降低基線噪音和漂移，提高檢測靈敏度，使峰形更穩定而無干擾［18］。

4 HPLC在高血壓中醫辨證分型中的應用

高血壓的中醫辨證分型主要有肝陽上亢、肝腎陰虛、陰陽兩虛、氣虛痰濁等，其中肝陽上亢型較為多見［19］。李寶國等［20］通過比較健康人與肝陽上亢型高血壓患者血漿的HPLC指紋圖譜發現，高血壓患者血漿HPLC圖譜與正常血漿HPLC圖譜有明顯的差異，可以用血漿HPLC圖譜方法輔助高血壓的診斷。蔣海強等［21］應用高效液相色譜質譜聯用和主成分分析的方法研究高血壓肝陽上亢證，通過對高血壓肝陽上亢患者和健康志愿者尿液樣品的分析和模式識別，顯示該方法能夠區分高血壓肝陽上亢患者和健康志愿者的尿液樣品。盡管在高血壓肝陽上亢患者和健康上造成了兩組樣本的交叉，但從主成分分析得分圖可以看出，兩組樣本基本能夠分開，且類別清晰、明確。該方法有利于深入認識和理解高血壓肝陽上亢證的本質，同時為該類疾病的臨床診斷和治療研究提供依據。

5 小結

高血壓發病機制比較復雜，并發癥多，患病率呈逐年上升趨勢，是心腦血管疾病的首要危險因素［22］，嚴重危害了人們的身心健康。高效液相色譜(HPLC)技術分析速度快、靈敏度高，可以準確地檢測樣品。應用高效液相色譜技術可以輔助診斷高血壓，進行較早和較準確的治療，使患者盡早脫離或者減輕高血壓的困擾。

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