β-欖香烯和NDV共修飾對脂質體瘤苗的免疫增強作用

高天慧 段芳齡 劉明月 李曉燕 戚麟

腫瘤疫苗作為手術及放療、化療的輔助治療常用來改善宿主的免疫狀態，調動機體的免疫反應，殺滅殘留在體內的腫瘤細胞。但是由于放療、化療的毒副作用及癌癥本身，患者的免疫系統往往處于抑制狀態，同時腫瘤抗原性弱，腫瘤細胞表達的MHC-I類分子減少或缺如，不能有效地將腫瘤抗原提呈給CD+8T細胞，因此，單純用腫瘤抗原進行免疫治療，往往不能誘導有效的抗腫瘤免疫反應。本研究采用新城疫病毒(Newcastle Disease Virus，NDV)losota株來修飾H22肝癌細胞，并將NDV修飾的H22肝癌細胞可溶性抗原(NDV-H22抗原)與免疫增強劑β-欖香烯共包于脂質體中，以期得到更進一步的抗瘤效應，為臨床抗肝癌治療提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 BalB/c純系小鼠，由河南省實驗動物中心提供，動物合格證號為SYXK(豫)2005-0012，4-6周齡，體重16～18 g，健康，清潔級飼養，60只，雌雄各半;小鼠 H22肝癌細胞由BalB/c小鼠腹腔傳代，引自河南省醫學科學研究所;新城疫病毒losota株由河南農業大學牧醫學院微生物教研室盧中華教授惠贈。大豆卵磷脂(PC)，上海油脂一廠;膽固醇(CH)，日本株式會社;十八烷氨(SA)，sigma;牛血清白蛋白，B1B公司;新生小牛血清，天津正江高新技術開發公司;淋巴細胞分離液，上海勁馬生物科技有限公司;β-欖香烯，大連金港制藥有限公司。Beckman高速低溫離心機，Beckman公司;Eppendorf高速低溫離心機C5417R，Eppendorf公司;CO2培養箱，美國A1SCO;旋轉蒸發儀，上海玻璃儀器二廠;倒置顯微鏡，日本OLYMPUS;酶聯免疫檢測儀，第四軍醫大學。

1.2 方法

1.2.1 新城疫病毒修飾H22肝癌細胞及可溶性抗原的制備參照文獻[1]進行。

1.2.2 脂質體的制備及包封率測定 參照我所建立的方法[1-3]略加改進。

1.2.3 瘤苗的治療實驗

1.2.3.1 分組 將60只 BalB/c小鼠隨機分為為3組，每組再分為兩部分，一部分用于觀察生存期，另一部分用來檢測淋巴細胞對H22肝癌細胞的體外殺傷效應。第1組為脂質體包裹NDV修飾的H22抗原組(LVAg組)，第2組為脂質體共包裹β-欖香烯和H22抗原組(LEAg組)，第3組為脂質體共包裹β-欖香烯和NDV-H22抗原組(LEVAg組)。

1.2.3.2 免疫治療程序 第1天各小鼠腹腔接種H22肝癌細胞1.1×106個/0.1 ml，24 h后腹腔接種各種疫苗0.1 ml，每毫升疫苗含3×107個H22肝癌細胞所含的抗原，第一次免疫后一周強化免疫一次。

1.3 淋巴細胞對H22肝癌細胞的體外殺傷試驗

1.3.1 脾淋巴細胞懸液的制備 第二次免疫后4 d，將用來檢測細胞毒作用的小鼠取出，常規腹部消毒，無菌取脾，DHanks沖洗，玻璃勻漿器勻漿后過200目金屬網，淋巴細胞分離液分離、制備淋巴細胞，用培養液調至5×105個/100 μ1。

1.3.2 脾淋巴細胞對H22肝癌細胞的體外殺傷試驗 參照黃永年[4]等的方法進行。

1.4 小鼠生存期的觀察 每天記錄各組小鼠存活數量，從接種之日起，連續觀察50 d，存活＞50 d者，認為長期存活。

1.5 統計學方法 用SPSS 11.5軟件，應用方差分析ONEWAY-ANOVA對生存期和淋巴細胞毒活性進行統計分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 KCl法提取的可溶性抗原的蛋白含量 每106個 H22肝癌細胞所抽提的蛋白為107μg，每106個NDV修飾后H22肝癌細胞所抽提的蛋白為119 μg。

2.2 脂質體的包封率 脂質體對LVAg、LEAg、LEVAg的包封率分別39.45%，44.38%和39.45%，對β-欖香烯的包封率為81.36%。

2.3 不同免疫治療的效應觀察

2.3.1 不同的免疫治療對BalB/c小鼠生存期的影響 對荷瘤小鼠分別用不同的疫苗制劑間隔1周進行連續兩次的免疫后，LVAg組、LEAg組和LEVAg組的平均生存期分別為(35.2±5.5)d、(37.8±3.7)d和(45.8±3.8)d，3組間差異有顯著性(F=15.823，P＜0.001)，其中，LEVAg組的平均生存期長于LVAg組(P＜0.001)和LEAg組(P＜0.001)，而后二者之間差異無顯著性(P=0.197)。

2.3.2 不同免疫治療組小鼠脾淋巴細胞體外殺傷H22肝癌細胞活性觀察 在效靶比為50:1時，LVAg組、LEAg組和LEVAg組的脾淋巴細胞毒活性分別為:(30.0±2.8)、(29.0±1.5)和(46.4±1.9)，3組間差異有顯著性(F=210.105，P＜0.001)，其中，LEVAg組的脾淋巴細胞毒活性強于LVAg組(P＜0.001)和LEAg組(P＜0.001)，而后二者之間差異無顯著性(P=0.322)。

3 討論

脂質體包裹可增加抗原的顆粒性，較可溶性抗原更易被抗原提呈細胞吞噬和提呈[5]。巨噬細胞對脂質體具有優先攝取，脂質體包裹的抗原可經巨噬細胞的MHC-Ⅰ途徑激活T細胞，發揮主要的抗瘤作用，同時又可經MHC-Ⅱ途徑激活CT細胞，T細胞(包括Th細胞)被激活后釋放細胞因子，一方面促進激活的T細胞的細胞毒活性，另一方面促進B細胞產生體液免疫，促進機體的抗瘤免疫作用。

病毒用于抗腫瘤免疫治療最初源于“病毒異種化作用”的概念，即通過使腫瘤細胞表面帶有外來病毒相關抗原，增強其免疫原性，易于為宿主的免疫系統識別。NDV是禽類的一種副粘液病毒，對癌細胞具有較強的親和力，可在癌細胞內大量復制，而對正常細胞影響不大[6]。體外實驗中，NDV致敏可顯著增加DC-CIK對于胃癌細胞株的殺傷力[7]。在臨床研究中，NDV修飾的自體腫瘤細胞疫苗能改善晚期結腸癌患者的生存[8]。

欖香烯為脂溶性的非細胞毒性的廣譜抗腫瘤藥物，同時又具有免疫增強作用。欖香烯能改變或增強腫瘤抗原的免疫原性，誘發或促進機體對腫瘤的免疫排斥作用[9]。此外，欖香烯能顯著提高荷瘤小鼠腹腔巨噬細胞吞噬率及吞噬指數，增強CONA誘導的小鼠脾細胞的增殖，增加NK細胞的活性[10]。

本研究用NDV修飾脂質體瘤苗，以增強腫瘤抗原的免疫原性，更易為宿主識別，同時用免疫增強劑欖香烯來刺激機體免疫反應，獲得了最強的抗瘤免疫效應，顯著高于單用NDV修飾脂質體瘤苗和單用欖香烯修飾脂質體瘤苗，提示二者的協同增效作用。免疫效應的增強可能源于欖香烯的免疫增強作用，NDV的抗原異源化作用，以及脂質體包裹后的抗原提呈的作用的加強。共包裹欖香烯和NDV修飾的脂質體肝癌瘤苗有潛在的臨床應用價值，為抗肝癌治療提供有效的補充手段，值得臨床進一步研究。

[1]高天慧，段芳齡，劉明月.NDV修飾對H22肝癌細胞脂質體瘤苗免疫作用影響的觀察.中華腫瘤防治雜志，2011，18(3):180-182.

[2]高天慧，段芳齡，高海玲，等.脂質體瘤苗抗小鼠H22腹水型肝癌作用研究.胃腸病學和肝病學雜志，2005，14(4):366-368.

[3]高天慧，段芳齡，周云，等.β-欖香烯對脂質體瘤苗抗小鼠H22肝癌的免疫增強作用.中國誤診學雜志，2005，12(5):3409-3411.

[4]黃永年，李薇.噻唑蘭比色法實驗條件的研究.中華醫學檢驗雜志，1992，15(4):229-230.

[5]Ying M，Reginr，Claudio T，et al.MHC class I-and classⅡ-restricted processingand presentation of microencapsulated antigens.Vaccine，1999，17:1047-1056.

[6]Ravindra PV，Tiwari AK，Sharma B，et al.Newcastle disease virus as an oncolytic agent.Indian J Med Res，2009，130(5):507-13.

[7]李輝，王震，毛偉征，等.新城疫病毒對胃癌細胞抗原修飾作用的研究.齊魯醫學雜志，2009，24(4):306-308.

[8]Schulze T，Kemmner W，Weitz J，et al.Efficiency of adjuvant active specific immunization with Newcastle disease virus modified tumor cells in colorectal cancer patients following resection of liver metastases:results of a prospective randomized trial.Cancer Immunol Immunother，2009，58(1):61-69.

[9]吳偉忠，劉廉達，湯曉雷，等.β-欖香烯誘導的抗腫瘤免疫保護作用機理初探.中華腫瘤雜志，1999，21(6):405-406.

[10]陳龍邦，臧靜，王靖華.β-欖香烯對荷瘤小鼠免疫功能的影響.腫瘤防治研究，1998，25(1):54.