松葉蜂病原真菌的分離鑒定及真菌寄生率的調查

楊苗苗，王玉珠，曲良建，李孟樓，段彥麗，張永安*

(1.西北農林科技大學林學院，陜西楊凌 712100;2.中國林業科學研究院森林生態環境與保護研究所國家林業局森林保護學重點實驗室，北京 100091;3.北京農業職業學院園藝系，北京 102400)

近年來，松葉蜂類害蟲對我國森林危害呈現不斷上升的趨勢，國內主要種類有落葉松葉蜂Pristiphora erichsonii、落葉松銼葉蜂 P．laricis、落葉松腮扁葉蜂Cephalcia lariciphila、松阿扁葉蜂Acantholyda posticalis、靖遠松葉蜂 Diprion jingyuanensis、南華松葉蜂 D．nanhuaensis、松鋸蜂 Diprion sp．、會澤新松葉蜂Neodiprion huizeensis、祥云新松葉蜂N．xiangyunicus、松黃葉蜂 N．sertifer、杉吉松葉蜂 Gilpinia disa等 30 多種［1－5］，分布于我國陜西、寧夏、甘肅、山西、山東、河北、四川、云南、廣西、浙江等20多個省(自治區)。

作者在云南、陜西、山西、寧夏、河北、甘肅等地對松葉蜂的病原真菌進行了采集、分離鑒定、毒力測試，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1．1 病原真菌來源 在云南、陜西、山西、寧夏、河北、甘肅等地采集落葉松葉蜂繭、落葉松銼葉蜂繭、落葉松腮扁葉蜂繭、靖遠松葉蜂繭、祥云新松葉蜂繭、松阿扁葉蜂幼蟲，收集其中的典型真菌侵染死亡的蟲繭。

1.2 病原真菌寄生率統計 隨機選取100枚以上松葉蜂蟲繭進行解剖，根據繭內幼蟲的病癥統計真菌寄生率。

1.3 病原真菌分離純化 在超凈臺上，用剪刀剪破蟲繭取出被真菌寄生的幼蟲僵尸，浸入70%乙醇中10～20 min，用無菌吸水紙吸干表面的乙醇，解剖幼蟲僵尸，取一小部分組織或用接種針直接挑取幼蟲表面的菌絲體置于PDA或馬丁氏培養基上，25℃恒溫箱中培養。4～6 d后在超凈工作臺上挑取長出的菌絲接入新的培養基上，25℃恒溫培養。以上程序重復數次，直到培養皿中的菌落大小、顏色、質地等穩定后，指形管保存菌種，待鑒定。

1.4 病原真菌初步鑒定 取待鑒定的真菌接種于盛有PDA培養基的培養皿中心位置，在培養皿2/3直徑處置無菌蓋玻片，其擱置方法為:玻片斜插入培養基中，傾角15°～20°。等培養皿中菌落邊緣到達蓋玻片時，即菌絲延伸至蓋玻片上時，取下蓋玻片，光學顯微鏡下觀察菌絲結構、孢子形態。并結合寄主幼蟲死亡癥狀和菌落大小、顏色、質地、生長速度、菌絲寬度、是否有隔膜、孢子梗形態等特征，進行初步鑒定［7－9］。

1.5 真菌的保存 在超凈臺上，將待保藏的真菌接入盛有培養基(斜面)的試管中培養(1株菌接4～5管)，25℃恒溫培養，取生長良好的菌株作為保藏菌種;用消毒棉塞塞緊試管管口，外包牛皮紙，直立放在冰箱中4℃保存［7］。

1.6 5株白僵菌的毒力測試 選取NG-1，NG-2，SH-1，GT-1，YB-1等5株白僵菌，配成濃度為1.0×108孢子/mL菌液，用毛筆涂抹在新鮮干凈的月季葉片上，晾干后喂食3齡月季葉蜂幼蟲，25℃下進行。每個菌株為1個處理，5個菌株共5個處理。每個處理3個重復，每個重復用30頭幼蟲。接菌后前2 d的死亡蟲數不計，從第3天開始計數，持續16 d。根據培養皿中死蟲表面是否有菌絲長出，蟲體是否僵硬等，計算死亡率、侵染率。

最后整理數據并采用Excel和SPSS統計分析軟件分析數據。

2 結果與分析

2.1 病原真菌寄生率 調查發現真菌寄生松葉蜂幼蟲期、繭蛹期、成蟲期的現象很普遍，但寄生率因松葉蜂種類和分布地不同而不同。松葉蜂繭期的主要病原為真菌(表1)，落葉松葉蜂繭期真菌寄生率較其它松葉蜂的高，寧夏固原地區落葉松葉蜂幼蟲期用白僵菌防治后，其繭的寄生率高達41.8%，未防治區僅為8.24%，防治區真菌的寄生率大約是未防治區的5倍，祥云新松葉蜂繭也有真菌寄生現象，真菌寄生率約為0.8%。

表1 幾種松葉蜂幼蟲期、繭期的病原真菌感病率

2.2 松葉蜂真菌鑒定結果分離鑒定出球孢白僵菌Beauveria bassiana 8株、布氏白僵菌B．brongniatii 4株、青霉屬Penicillium sp．真菌1株，并對以上真菌的發生狀況進行統計分析(表2)。

從表2可以看出，菌落大小方面SH-1、GT-1菌落較大，遠遠超出了其他11株，菌絲寬度和分生孢子直徑在1.9～3.1 μm之間。

2.3 5株白僵菌毒力測試結果 根據16 d的試驗記錄，計算接種后月季葉蜂累計死亡率、總死亡頭數、總死亡率、總校正死亡率(表3)。對不同菌株感染試蟲后的累計死亡數、總死亡數逐日進行多重比較分析發現:前4 d各處理間均無顯著差異，從第6天起，不同菌株與對照比較均有顯著差異，第14天起GT-1和其它各菌株之間有顯著差異;對使用不同菌株后試蟲的總死亡數進行統計分析發現:各菌株與對照之間均有顯著差異，菌株GT-1與菌株NG-1，NG-2有顯著差異;以上菌株中GT-1對月季葉蜂幼蟲的致死作用最好，其它依次為:SH-1，YB-1，NG-2和NG-1。各菌株的校正死亡率從大到小依次為:GT-1，91.0%;SH-1，82.8%;YB-1，75.0%;NG-2，73.2%;NG-1，69.5%。

表2 4種松葉蜂繭寄生真菌鑒定結果

表3 不同菌株感染試蟲不同時間的累計死亡數、死亡率、校正死亡率

3 結論與討論

松葉蜂類害蟲真菌寄生主要集中在繭期，主要為白僵菌;落葉松葉蜂繭期真菌寄生率普遍高于其它松葉蜂。

本試驗利用菌落、菌絲、孢子形態進行了初步的鑒定，而要更準確鑒定需要借助分子生物學手段;選取5株白僵菌毒力測試的結果顯示，對月季葉蜂的致死作用都在69.5%以上，而其它7株的毒力有待進一步測試。Führer［10］研究發現真菌無法穿透完好無損的繭壁，即繭壁具有抵擋真菌侵染的功能，真菌侵染蛹是在結繭前期，同時提出結繭前期土壤中真菌孢子的濃度是影響真菌侵染的關鍵因子之一。所以在利用真菌防治該類害蟲時，要選擇好使用時間，并考慮有利于真菌繁殖的各類氣候因素，以期達到較好的防治效果。

［1］ 蕭剛柔，黃孝運，周淑芷，等．中國經濟葉蜂志:I［M］．陜西:天則出版社，1991:85－103．

［2］ 蕭剛柔．中國森林昆蟲［M］．2版．北京:中國林業出版社，1991:1144－1200．

［3］ 蕭剛柔．危害油松的一種新葉蜂(膜翅目:松葉蜂科)［J］．林業科學研究，1994，7(6):663 －665．

［4］ 周淑芷，張真．我國松葉蜂研究概況及發展方向［J］．林業科技通訊，1994(11):10－12．

［5］ 蕭剛柔，黃孝運，周淑芷．中國松葉蜂(Diprionidae)昆蟲研究［J］．林業科學，1985，21(1):30 －34．

［6］ Bird F T．The use of a virus disease in the biological control of the European pine sawfly，Neodiprion sertifer(Geoffr．)［J］．Can Entomol，1953(85):437 －446．

［7］ 姚占芳，吳云漢．微生物學試驗技術［M］．北京:氣象出版社，1998:23－47．

［8］ 邵力平，沈瑞祥，張素軒，等．真菌分類學［M］．北京:中國林業出版社，1984:110－130．

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［10］ E Führer S．Studies on the significance of pathogenic fungi in the population dynamics of the lesser Spruce Sawfly Pristiphora abietina Christ．(Hym．，Tenthredinidae) ［J］．Rosner A Applide Entomllogy，2001(125):235 －242．