卵巢癌患者術前、術后、復發及化療過程中血清蛋白質差異表達研究

趙 晉，湯 泓，李紅霞

（首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院 婦產科，北京100038）

卵巢癌是一種多因素、多基因參與的復雜疾病。隨著人類基因組計劃的完成，人們更加清楚地認識到：基因組是一個靜態的信息源，它具有確定的基因內容，即無論細胞類型或環境條件如何，除極少數情況外，它總是維持不變。因此，基因間的功能關系必須在轉錄和蛋白質組水平上加以研究。蛋白質組（proteomics）是在一定條件下由一個特定的細胞或生物體產生的所有蛋白質。細胞通過調控其蛋白質的表達水平和活性來適應內外環境的改變，所以，蛋白質組無論是在質或量上的改變都反映了處于功能活動中的細胞的一種狀況［1，2］。因此用蛋白質組學方法從整體水平上研究腫瘤的發病機制，尋找腫瘤診斷和預后的特異性標志物，以及藥物治療的靶標等均已成為近期研究的熱點。

本研究采用最常用的一種蛋白指紋圖譜技術——表面增強激光解析電離飛行時間質譜（SELDI－TOF－MS），對就診于我院并進行手術治療及術后化療的9例卵巢癌患者進行了跟蹤隨訪，共收集到37份血清標本。對上述標本分別進行了蛋白質譜分析，觀察卵巢癌患者術前、術后、復發及化療過程中血清蛋白質變化，探討卵巢癌發生、發展及復發過程中血清質譜多肽蛋白圖譜變化，旨在篩選新的與卵巢癌發生、發展與復發密切相關的蛋白質或多肽，為臨床診斷卵巢癌提供可能的血清腫瘤標志分子。

1 材料和方法

1.1 研究對象

所有血清標本均取自北京世紀壇醫院婦科初診卵巢癌患者。7例卵巢癌患者的年齡為40－69歲，平均52.8歲。均為漿液性腺癌。均收集術前（7份）、術后（不同時間22份）血清標本。其中復發患者3例，包括復發后（不同時間8份）血清標本。血清標本總數共37份。

按2000年國際婦產科聯盟（FIGO）手術病理分期，Ⅰ期1例，Ⅱ期3例，Ⅲ期5例。術式均采用腫瘤細胞減滅術，均在術后2周內開始接受正規化療，采用化療方案為Pt（順鉑＋紫杉醇）或PC（順鉑＋環磷酰胺）。所有患者的組織標本均經術后病理證實。

1.2 主要試劑與儀器

尿素（urea）、乙腈（CAN）、3－環乙胺－1－丙磺酸（CHAPS）、三氟乙酸（TFA）、芥子酸（SPA）均購自Sigma公司；SELDI質譜儀及CM 10弱陽離子芯片購自于美國BIORAD公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品的收集與血清樣本制備 將采集的靜脈血4℃靜置2h后離心（4 000rpm，10min），取上清液按100μl/管分裝，置于－80℃冰箱中保存，凍存前在標本管上詳細標號。－80℃冰箱中取出血清樣品，置冰盒上融解；以10，000rpm，4℃離心2 min；每個樣品取10μl分別置于1.5ml離心管中，加20μl U9緩沖液稀釋，充分混勻；將以上樣品冰浴振蕩30min（或每隔5min用手指輕彈混勻一次）。將30μl上述變性后樣品加入370μl相應的結合緩沖液，使得血清的總稀釋倍數達到40倍。混勻，避免氣泡產生。

1.3.2 SELDI－TOF－MS檢測 取出 CM10的芯片，在芯片背后標記時間，芯片種類，操作者的姓名等資料。將芯片裝入生物芯片處理器。每孔加入200μl結合緩沖液（50mM NaAC，pH 4.0），置振蕩器400－600rpm/min震蕩5min，甩掉緩沖液。重復上述操作一次。在芯片處理器每孔中加入100μl處理好的樣品，置振蕩器400－600轉/min，4℃震蕩1h。甩出樣品，重復操作一次。每孔加入200μl HPLC水，立刻甩出。立刻拆開芯片處理器，取出芯片后，待干后，在每個加樣孔上加SPA 0.5μl，待干后，重復加SPA 0.5μl一次。待干后，即可上機測定。

在讀取數據前，用加有All－in－one標準蛋白質的NP20芯片校正質譜儀，使分子量誤差＜0.1%。設定儀器主要參數：激光強度130，檢測靈敏度8，優化分子量范圍2 000－15 000Da，最佳聚焦中心6000，數據采集參數范圍20－80，收集點數為100次。設定讀片程序，計算機根據所獲得的原始數據快速精確地繪制出蛋白質質譜圖，其中縱坐標為波峰強度，即蛋白質相對含量，橫坐標為質荷比（M/Z），即蛋白質相對分子量。

1.4 統計學方法

應用Biomarker Wizard和Patterns軟件分析處理所有峰譜，形成蛋白指紋圖譜。用SPSS 13.0軟件對各組血清的波峰強度進行統計學分析（符合方差齊性的應用方差分析，不符合方差齊性的用多個獨立樣本的非參數檢驗），然后應用Biomarker Patterns軟件建立樹形分類模型。

2 結果

2.1 通過SPSS 13.0軟件統計分析，在7份卵巢癌術前、22份卵巢癌術后及8份復發性卵巢癌患者的血清蛋白中共檢測到26個差異表達的蛋白（P＜0.05）。

在卵巢癌術前、術后自身對照研究中，卵巢癌術前組蛋白峰平均強度/卵巢癌術后組蛋白峰平均強度≥2的蛋白峰有1個（1452.58Da），說明該蛋白峰在卵巢癌術前組中高表達。卵巢癌術前組蛋白峰平均強度/卵巢癌術后組蛋白峰平均強度≤0.5的蛋白峰有4個（8785.20，1659.79Da，4253.91Da，5603.31Da），其中 m/z為8785.20的蛋白峰與Apo C－Ⅲ的質核比相符。說明該蛋白峰在卵巢癌術前組中低表達。

2.2 在卵巢癌術前、術后及復發組對照研究中，差異表達的蛋白峰有2個，其中m/z7991.89Da的蛋白峰術前、術后及復發時的蛋白質平均強度分別為14.67、5.75、12.28（P值＝0.002）；m/z 8093.54Da的蛋白峰術前、術后及復發時的蛋白質平均強度分別為3.12、0.71、2.81（P值＝0.002）。

3 討論

3.1 患者手術前后差異表達的蛋白峰的意義

卵巢惡性腫瘤的發病率，在女性常見惡性腫瘤中所占的百分率為2.4%－5.6%。在女性生殖道癌瘤中占第3位，次于宮頸癌及宮體癌。而在女性生殖道癌瘤中，卵巢癌是死亡率最高的一種腫瘤［3］。據文獻報道，目前卵巢癌總的治療有效率為70%－80%，然而經病理學證實完全有效者，復發率仍為40%－60%。因此，對卵巢癌患者進行有效的隨訪觀察，盡早發現腫瘤復發具有重要的意義。

本研究選取了7位卵巢癌患者進行手術前后自身對照研究。我們設想的是，手術可明顯減少腫瘤負荷，因此，應用SELDI－TOF－MS技術檢測卵巢癌患者手術前后自身對照血清蛋白質成分的改變，有望了解患者進行腫瘤細胞減滅術的效果和機體對手術的反應程度，并可篩選出評價手術效果及判定復發的潛在標志物。結果顯示卵巢癌患者在術前及術后存在差異表達的蛋白峰，這些蛋白峰可能來自自于宿主器官、病變本身或機體的代謝或免疫產物，得到有統計學差異的蛋白峰5個，推測它們可能是卵巢癌發生及發展中具有功能的一組蛋白或多肽。其中卵巢癌術前組蛋白峰平均強度/卵巢癌術后組蛋白峰平均強度≥2的蛋白峰有1個（1452.58Da），說明該蛋白峰在卵巢癌術前組中高表達。推測可能是因為該蛋白在腫瘤組織中表達增強，可能與腫瘤的發生發展有關，而術后腫瘤負荷降低，該蛋白峰表達下降。卵巢癌術前組蛋白峰平均強度/卵巢癌術后組蛋白峰平均強度≤0.5的蛋白峰有4個（8785.20，1659.79Da，4253.91Da，5603.31Da），說明該蛋白峰在卵巢癌術前組中低表達。推測可能是機體產生的重要的保護因素或抑癌因子，術后腫瘤負荷降低，對免疫因子的消耗減少，故術后血清中相應蛋白含量升高；也有可能是與代謝有關的蛋白，術后腫瘤負荷降低，代謝水平降低，消耗較少，故相應蛋白水平升高。本研究中，通過對蛋白質組學的同源性分析，發現m/z為8785.20的蛋白峰與載脂蛋白Apo C－Ⅲ的質核比相符。觀察該蛋白峰在術前術后及復發時的變化，可見該蛋白峰在術前低表達，術后表達升高，與文獻報道一致［4－6］。說明該蛋白峰與腫瘤的發生和發展密切相關。推測其可能因腫瘤存在，代謝旺盛，腫瘤負荷加大了該蛋白的消耗。

3.2 卵巢癌復發患者差異表達的蛋白峰的意義

在卵巢癌領域內，盡管迄今對復發性卵巢癌的治療仍為姑息性治療，但是，對于復發性卵巢癌患者來說，及早明確診斷并治療，對于延長生存時間及改善生存質量有著重要意義。本研究中，我們選取了卵巢癌術前、術后及復發組進行蛋白質組學對比研究，我們設想的是，手術可明顯減少腫瘤負荷，而術后復發，腫瘤負荷再次加大，蛋白峰的變化應與術前－術后的變化趨勢相反，但術前及復發組因腫瘤負荷不同，故變化幅度可能會與術前－術后不同。因此，應用SELDI－TOF－MS技術檢測卵巢癌患者手術前后及復發組對照血清蛋白質成分的改變，有望了解手術及腫瘤復發對機體影響及機體的反應，并可篩選出評價手術效果及判定復發的潛在標志物。結果發現符合卵巢癌術前組峰值平均強度/術后組峰值平均強度≥2且卵巢癌術后組峰值平均強度/復發組峰值平均強度≤0.5的蛋白峰有2個（7991.89Da，8093.54Da）說明該蛋白峰在機體存在腫瘤時表達增強。推測該蛋白峰可能來自于腫瘤組織，在腫瘤發生及發展過程中不斷釋放入血而引起血清該蛋白或肽段含量升高。

［1］Posadas EM，Davidson B，Kohn EC.Proteomics and ovarian cancer：implications for diagnosis and treatment：a critical review the recent literature［J］.CurrOp in Oncol，2004，16（5）：478.

［2］Da－EleneM，Katerina O，John M，et al.Mass Spectrometry：Uncovering the Cancer Proteome for Diagnostics［J］.Adv Cancer Res，2006，96（2）：23.

［3］Farias－Eisner R，Teng F，Oliveira M，et al.The influence of tumor grade，distribution，and extent of carcinomatosis in minimal residual stage III epithelial ovarian cancer after optimal primary cytoreductive surgery［J］.Gynecol Oncol，1994，55：108.

［4］王 靜.雙向凝膠電泳－質譜技術行卵巢癌血漿標志物分析［J］.中國實用婦科與產科雜志，2009，25（1）：34.

［5］Chen J，Anderson M，David EM，et al.Characterization of apolipoprotein and apolipoprotein precursors in pancreatic cancer serum samples via two－dimensional liquid chromatography and mass spectrometry［J］.J of Chromatogr A，2007，1162 （2）：117.

［6］邱繼剛，樊 嘉，劉銀坤，等.肝細胞癌門靜脈癌栓相關血清小分子量蛋白質標志物的篩選［J］.中華肝臟病雜志，2007，15（7）：498.