PTSD大鼠模型的實驗研究

王 芳

創傷后應激障礙(posttraumatic stress disorder，PTSD)是指受到親身經歷或目睹的異乎尋常的威脅性、災難性事件所致的心理創傷，導致出現長期持續性精神障礙［1］。在競爭日益激烈的現代社會，應激事件日趨增多，PTSD的發生呈明顯上升趨勢，對PTSD的研究，可有效降低應激人群PTSD的發生，促進應激人群的身心健康。反復發生的闖入性體驗的病理性重現和不自主地反復回想是PTSD最具特征性的癥狀，關于這一病理性記憶增強的神經和分子機制目前尚不明確。PTSD除具有一般精神疾病癥狀外，其患者血清皮質醇往往處于較低水平［2］。本研究采用SPS方法建立PTSD大鼠模型，測定大鼠行為學改變和血清皮質醇濃度，驗證PTSD模型的準確性。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和主要儀器設備試劑

成年雄性Wistar大鼠20只，體重160±20g，由中國醫科大學實驗動物中心提供。動物在用于實驗前先適應性飼養1w。Morris水迷宮，中國醫學科學院藥物研究所。皮質醇化學發光法測定試劑盒，南京建成生物公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 PTSD模型的建立 隨機將大鼠分為對照組(10只)和模型組(10只)。采用SPS方法建立PTSD模型:在適應性飼養1w后，對大鼠進行連續3次的不同刺激，分別為:禁錮2h、強迫性游水20min(水深40cm，水溫25℃)和乙醚麻醉至大鼠意識喪失，其中強迫游泳和乙醚麻醉間隔15min。麻醉后將大鼠置于通風處至自然蘇醒，放回飼養籠，無干擾喂養，常規飲食。

1.2.2 高架十字迷宮(elevated plus maze，EPM)實驗OF實驗后，進行EMP實驗。將大鼠置于高架十字迷宮中央區，頭朝開臂。通過上方的攝像機記錄5min內大鼠的活動情況。每只大鼠測試完畢后徹底清理迷宮。測量開臂進入次數百分比和開臂滯留時間百分比。

1.2.3 水迷宮(Morris water mace，MWM)實驗 EPM實驗結束后，對大鼠進行MWM實驗，水溫24℃。首先進行獲得性訓練4d，于5d時進行的MWM測試，前4d僅用于對動物的訓練。取d5的測試成績作為動物的空間學習記憶成績。

1.2.4 恐懼記憶的行為測定(僵立行為測定) 另取兩組大鼠各5只，于造模7d后，放入游泳用的玻璃缸內，測4min僵立行為。每10s測1次，表現為僵立行為為陽性，所得陽性次數之和占總次數的百分比為僵立時間百分比。

1.2.5 血清皮質醇濃度監測 僵立行為測定完成后，經大鼠心采血3～5ml，3000r/min離心10min，收集血清。用化學發光法檢測血清皮質醇濃度。

1.2.6 統計學分析 所得數據使用SPSS13.0統計分析軟件。計量資料用平表示。采用t檢驗進行統計學檢驗，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 EMP 實驗結果

EMP結果表明，大鼠活動符合大鼠趨暗的自然屬性，即大鼠趨向于在光線暗處活動。大鼠在閉臂內活動時間和路程顯著多于開臂。隨著大鼠對環境的逐漸適應，大鼠向開臂內的探究行為逐漸增多。模型組和對照組大鼠在開臂內停留時間所占總臂內停留時間比分別為11.9±1.3和18.7±1.7，模型組顯著低于對照組，差異具有統計學意義(t=6.837，P＜0.01)。模型組和對照組大鼠進入開臂次數占總進臂次數的百分比分別為 21.3 ±2.2 和37.8 ±2.9，模型組顯著低于對照組，差異有統計學意義(t=10.295，P＜0.01)。

2.2 MWM 實驗結果

對照組與模型組大鼠平均逃避潛伏期分別為5.63s±1.06s、20.76s±3.24s，模型組顯著高于對照組，差異具有統計學意義(t=9.932，P ＜0.01)

2.3 僵立行為測定結果

模型組大鼠再次放入玻璃缸中后(重新面臨恐懼情景時)，大鼠表現為明顯的僵立行為:活動明顯減少，主要表現為刻板的蹲伏行為，僅頭部有輕微的轉動，背部拱起。同時大鼠還表現出全身情緒喚起的其他表現(例如可見大鼠全身毛發豎立)。對照組大鼠重新面臨恐懼情景時，行為模式與模型組顯然不同。表現為自由運動，出現探究、理毛等行為。分析結果顯示，對照組僵立行為百分比為12.5±4.2，模型組為60.0 ±7.6，兩組之間差異有統計學意義(t=12.275，P ＜0.01)。

2.4 血清皮質酮濃度

對照組與模型組大鼠血清皮質酮濃度分別為1.26μg/dl±0.17μg/dl和 0.54 μg/dl± 0.13μg/dl，差異有統計學意義(t=7.34，P ＜0.01)。

3 討論

PTSD的基礎研究應用嚙齒類動物做了一些動物模型，包括海馬驚厥閾下電刺激模型、單次強烈應激模型(包括電擊、溺水傷害、外傷、應激-再應激、捕食者應激等單獨使用以及多種應激序列使用等)、使用外源性皮質激素等［3～5］。其中強烈應激模型更能模擬人類PTSD。SPS是一種PTSD動物模型，能表現PTSD的臨床癥狀和神經內分泌改變，是國際公認的 PTSD 動物模型［6，7］。Liberzon等人報道，SPS小鼠表現出于PTSD患者同樣的HPA軸的抑制現象［8］。

本實驗應用高架十字迷宮實驗、Morris水迷宮實驗、僵立行為實驗等，驗證SPS大鼠的行為學改變。EMP實驗是進行焦慮研究的較新方法。其原理是嚙齒類動物有探究行為，放入高架十字迷宮后會主動探究開臂，但又懼怕開臂中高懸敞開的環境。動物出現焦慮時，開臂探究活動減少。本研究EMP實驗結果表明，大鼠在閉臂內活動時間和路程顯著多于開臂。隨著大鼠對環境的逐漸適應，大鼠向開臂內的探究行為逐漸增多。模型組大鼠在開臂內停留時間百分比和進入開臂次數百分比顯著低于對照組。結果和OF實驗結果一致，均提示SPS能增加大鼠的焦慮狀態。MWM實驗是一種強迫實驗動物游泳，學習尋找隱藏在水中平臺的一種實驗，主要用于測試實驗動物對空間位置覺和方向覺的學習記憶能力。本實驗結果表明，模型組大鼠尋找平臺的逃避潛伏期顯著高于對照組，說明SPS應激能損傷大鼠的空間記憶能力。僵立行為是一種普遍見于嚙齒類動物的防御行為，是大鼠在負性刺激無法避免時的一種防御反應，表現為刻板的蹲伏行為，全身除呼吸外其余肌肉運動均消失。本實驗結果顯示，模型組大鼠放入玻璃缸后，表現為典型的僵立行為，即刻板的蹲伏行為、僅頭部有輕微轉動、背部拱起、全身毛發豎立。對照組則表現自由活動，出現探究、理毛等行為。統計分析結果顯示模型組僵立行為百分比顯著高于對照組。表明SPS可使大鼠獲得對恐懼情景的記憶，說明該模型較好地模擬了PTSD的核心癥狀——病理性恐懼記憶增強。研究表明，PTSD患者血清皮質醇往往處于較低水平［2］，這是PTSD的一個主要的神經內分泌指標。本實驗測定了大鼠血清皮質酮濃度，結果表明模型組血清皮質酮濃度顯著低于對照組。

由此可見，SPS應激能誘發大鼠活動習性明顯改變，獲得對恐怖情景的記憶，并且有顯著的神經內分泌改變。這些基本符合PTSD主要的臨床表現，說明模型復制成功。

［1］Li S，Murakami Y，Wang M，et al.The effects of chronic valproate and diazepam in a mouse model of posttraumatic stress disorder［J］.Pharmacol Biochem Behav，2006，85(2):324 －331.

［2］Yehuda R，Bierer LM，Schmeidler J.Low cortisol and risk for PTSD in adult offspring of holocaust suirivors［J］.Am J Psychiatry，2000，157(8):1252－1259.

［3］Wakizono T，Sawamura T，Shimizu K，et al.Stress vulnerabilities in an animal model of post-traumatic stress disorder［J］.Physiol Behav，2007，90(4):687 －695.

［4］Cohen H，Kaplan Z，Matar MA，et al.Anisomycin，a protein synthesis inhibitor，disrupts traumatic memory consolidation and attenuates posttraumatic stress response in rats［J］.Biol Psychiatry，2006，60(7):767－776.

［5］Cohen H，Kaplan Z，Matar MA，et al.Long-lasting behavioral effects of juvenile trauma in an animal model of PTSD associated with a failure of the autonomic nervous system to recover［J］.Eur Neuropsychopharmacol，2007，17(6 －7):464 －477.

［6］Kohda K，Harada K，Kato K，et al.Glucocorticoid receptor activation is involved in producing abnormal phenotypes of single-prolonged stress rats:A putative post-traumatic stress disorder model［J］.Neuroscience，2007，148(1):22 －33.

［7］Yamamoto S，Morinobu S，Fuchikami M，et al.Effects of single prolonged stress and D-cycloserine on contextual fear extinction and hippocampal NMDA receptor expression in a rat model of PTSD［J］.Neuropsychopharmacology，2008，33(9):2108 －2116.

［8］Liberzon I，López JF，Flagel SB，et al.Differential regulation of hippocampal glucocorticoid receptors mRNA and fast feedback:relevance to post-traumatic stress disorder［J］.J Neuroendocrinol，1999，11(1):11－17.