中藥復方對Lewis肺癌移植鼠腫瘤微環境中吲哚胺2，3－雙加氧酶表達的影響

王成剛 蔣霆輝 陳越 范濟輝 張微微 沈旭波

（1.復旦大學附屬中山醫院分部放射科，上海 200052；2.上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院放射介入科，上海 200437）

腫瘤的免疫治療療效不理想的一個很重要的原因是與腫瘤細胞相關的免疫耐受和免疫逃逸機制的存在，機體免疫系統無法對腫瘤細胞進行有效的識別和殺傷。吲哚胺2，3－雙加氧酶（indoleamine 2，3－dioxygenase，IDO）是人體內肝外色氨酸代謝限速酶，最近研究［1－2］顯示多種細胞通過高表達IDO，導致腫瘤局部色氨酸代謝異常及調節性T細胞形成，對T細胞的增殖、分化和活性產生影響，進而介導腫瘤局部的T細胞免疫耐受。本研究通過研究中藥復方對Lewis肺癌移植鼠腫瘤微環境中IDO表達的影響，探討從傳統中醫藥角度開發新型IDO抑制劑的可行性。

1 資料與方法

1.1 實驗材料 注射用順鉑（cisplatin，DDP）20 mg／瓶。實驗所用中藥復方由黃芪、黨參、蜂房、仙鶴草、七葉一枝花、山萸肉、山海螺、漏蘆等組成，水煎，濃縮至生藥含量為2.0g／mL，4℃保存。

1.2 實驗動物及分組 近交系C57BL／6純系小鼠，64只，雌性，體質量16～18g，4～6周齡。將制備好的Lewis肺癌細胞懸液（約含活細胞數1.5×106個／mL，由上海醫工院實驗動物中心提供）以0.2 mL／只接種于小鼠右腋皮下造模。接種后將小鼠隨機分為4組：對照組、化療組、中藥復方組（簡稱中藥組）、中藥復方加化療組（簡稱綜合組），每組16只。接種后第5天開始給藥，給藥劑量根據人鼠體表面積折合法計算。對照組以0.9%氯化鈉液0.4mL灌胃14d；化療組于給藥的第1、第3、第5天，DDP溶液1mL（含DDP 0.1mg）腹腔注射化療，同時0.9%氯化鈉液0.4mL灌胃14d；中藥組以中藥復方藥液0.4mL（含生藥0.8g）灌胃14d。綜合組的化療同化療組，中藥復方用法同中藥組。各組均每天灌胃1次。將小鼠頸椎脫臼處死，剝離腫瘤組織進行檢測。

1.3 觀測指標及方法

1.3.1 腫瘤體積變化 自第7天起，每3天用游標卡尺測量每只小鼠腋下腫瘤長徑（L）和短徑（W），用Steel公式計算腫瘤體積：V＝LW2／2。處死小鼠后稱取瘤質量，并觀察抑瘤率。抑瘤率（%）＝（空白對照組平均瘤質量－實驗組平均瘤質量）／空白對照組平均瘤質量×100%。

1.3.2 EnVision法免疫組化 按常規進行；腫瘤組織IDO蛋白表達水平檢測采用western blot方法進行。

1.4 統計學處理 所有數據以均數±標準差（ˉx±s）表示。2組間比較用 Mann－Whitney U檢驗，多重比較校正檢驗水準為0.05／6＝0.0083。

2 結 果

2.1 各組瘤質量及抑瘤率比較 各組小鼠的成瘤率為100%，各組平均瘤質量分別為：對照組（2.370±1.59）g，化療組（1.233±0.44）g，中藥組（2.211±0.87）g，綜合組（0.805±0.49）g。綜合組的瘤質量顯著低于其余3組（P＜0.01），化療組與中藥組無顯差異著（P＞0.05）。抑瘤率依次分別為：中藥組31.67%，化療組64.17%，綜合組80.84%。

2.2 治療后各組IDO免疫組化OD值比較 各組治療后lweis肺癌細胞中IDO免疫組化OD值分別為：對照組（11.750±0.461），化療組（10.250±0.194），中藥組（10.562±0.182），綜合組（9.375±0.202）。4組間比較，差異有統計學意義（H＝24.887，P＜0.001）。

2.3 Westem blot法檢測IDO蛋白表達水平 采用Westem blot方法，對小鼠腫瘤組織中IDO蛋白表達水平檢測，將各樣品目的蛋白量分別除以其內參含量，得到的數值即為內參校正后的各樣品中目的蛋白相對含量，對照組為1.688，化療組為1.232，中藥組為1.562，綜合組為0.949。IDO在對照組中的表達顯著高于綜合組。

3 討 論

免疫逃逸是腫瘤細胞的基本特征。腫瘤細胞可表達多種機體免疫系統能夠識別并產生特異性免疫應答的腫瘤抗原，同時，各種腫瘤細胞可通過許多途徑來逃避機體的免疫監視。導致所謂的腫瘤免疫耐受。研究腫瘤的免疫逃逸機制對于研究腫瘤發生發展原理、提高機體免疫狀態、逆轉腫瘤的逃逸、設計新的治療策略具有極大的促進作用。

中醫藥在這方面顯然有著自身的優勢。我們的前期研究發現，傳承自上一輩中醫腫瘤名家的中藥經驗復方具有調節荷瘤小鼠T淋巴細胞增殖、降低腫瘤微環境中調節性T細胞（regulatory T cells，Treg）水平的作用。隨著對IDO和Tregs在腫瘤免疫耐受機制中的重要作用及其兩者之間相互作用關系的深入研究，眾多研究者希望將兩者結合應用到抗腫瘤免疫治療中。

有研究［3］顯示IDO在肺癌組織中呈高表達，且與腫瘤轉移、進展密切相關，并且化療對其表達有影響。

目前成功的細胞毒性化療正面臨腫瘤免疫耐受的挑戰：一是化療引起腫瘤細胞死亡釋放腫瘤相關抗原，在腫瘤抗原遞呈過程中產生免疫耐受；二是化療會引起階段性的淋巴細胞減少和穩態的破壞，在此期問T細胞更易發生免疫耐受而不是免疫應答，T細胞的免疫耐受導致腫瘤化療的失敗。本研究顯示，中藥復方及化療藥物順鉑均可在不同程度上影響Lewis肺癌移植鼠腫瘤組織中IDO表達水平，同時中藥復方配合化療藥物順鉑具有協同作用，對于調控肺癌微環境中IDO均顯示與單一治療相比存在一定治療優勢。這為今后從中醫藥角度研究IDO抑制劑提供了新的思路。

［1］ Prendergast GC.Immune escape as a fundam ental trait of cancer：focus on IDO［J］.Oncogene，2008，27（28）：3889－3900.

［2］ Katz JB，Muller AJ，Prendergast GC.Indoleamine 2，3－di oxygenase in T－cell tolerance and tumoral immune escape［J］.Immunol Rev，2008，222（4）：206－221.

［3］ Sim SH，Ahn YO，Yoon J，et al.Influence of chemotherapy on nitric oxide synthase，indole－amine－2，3－dioxygenase and CD124expression in granulocytes and monocytes of non－small cell lung［J］.Cancer Sci，2012，103（2）：155－160.