苦參素抑制肝纖維化的臨床研究

張建榮 李麗華 范書平 張?jiān)蛮i

肝纖維化(hepatic fibrosis)是機(jī)體對(duì)慢性肝損傷的一種修復(fù)反應(yīng)，是一種漸進(jìn)的病理過(guò)程，是慢性肝病的共有病理變化。肝纖維化的特征改變是肝臟內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的過(guò)度增生和異常沉積，嚴(yán)重者的肝纖維化可導(dǎo)致肝硬化，甚至引起肝功能衰竭［1］。目前從肝纖維化發(fā)生發(fā)展的不同環(huán)節(jié)入手研制了許多抗纖維化藥物，但仍未有十分確定、特效的藥物，因此，尋找理想的抗肝纖維化藥物及有關(guān)肝纖維化發(fā)病機(jī)制的闡明，具有重要的理論和臨床意義?？鄥⑺?Oxymatrine)是從中藥苦豆子或苦參根中提取的一種生物堿，研究顯—示苦參素有防止肝纖維化的作用［2，3］，但其作用機(jī)制及調(diào)節(jié)途徑未完全明確。本研究從細(xì)胞因子水平進(jìn)一步探討苦參素抗肝纖維化的作用機(jī)制，為苦參素的臨床防治肝纖維化提供指導(dǎo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2010年1月至2011年12月在本院住院的患有慢性肝纖維化的患者100例，隨機(jī)分為治療組和對(duì)照組。對(duì)照組50例，男45例，女5例;年齡28～52歲，平均年齡(40±6)歲;治療組50例，男44例，女6例;年齡26～55歲，平均年齡(40±8)歲。2組患者在年齡，性別和治療前肝功能檢測(cè)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，有可比性。

1.2 治療方法 2組患者均給予常規(guī)護(hù)肝及支持治療等一般治療。治療組在一般治療的基礎(chǔ)上給予苦參素氯化鈉注射液0.6 g(100 ml)，靜脈滴注，1次/d，療程 8 周，治療期間均不加用其他抗肝纖維化的藥物。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 血清學(xué)檢查:對(duì)照組和治療組所有患者抽取靜脈血3 ml，離心后分離血清，送化驗(yàn)室檢測(cè)。檢測(cè)項(xiàng)目如下:①肝功能指標(biāo)檢測(cè):利用HF-240全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、白蛋白(ALb)和總膽紅素(TBiL)的變化。②血清肝纖維化指標(biāo)檢測(cè):利用放免分析法檢測(cè)透明質(zhì)酸(HA)、層黏蛋白(LN)、Ⅲ型前膠原肽(PC-Ⅲ)和Ⅳ型膠原(CⅣ)的變化。③轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)、白介素10(IL-10)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)檢測(cè):利用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)TGF-β1和IL-10;利用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)TNF-α的變化。

1.3.2 肝穿刺后Ⅰ型膠原(CⅠ)和Ⅲ型膠原(CⅢ)檢測(cè):對(duì)照組和治療組各10例患者經(jīng)局部麻醉，在CT的定位和引導(dǎo)下經(jīng)皮膚穿刺，獲取肝臟標(biāo)本約15 mg。肝組織入4℃裂解液勻漿5 min，4℃離心，取上清，Bradford法測(cè)定樣本蛋白濃度。樣本蛋白經(jīng)12%SDS-PAGE凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，脫脂奶粉室溫封閉2 h，1∶300稀釋的collagenⅠ，Ⅲ抗體和MMP13抗體4℃過(guò)夜，二抗(1∶3 000稀釋)與硝酸纖維素膜雜交。將膜置于ECL中1 min，曝光，顯影，定影。采用美國(guó)Kodak公司ID數(shù)碼成像分析系統(tǒng)軟件對(duì)Western blot結(jié)果進(jìn)行定量分析，結(jié)果以目的蛋白與β-actin的積分光密度值的比值表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝功能指標(biāo) 對(duì)照組與治療組治療后ALT、AST和TBiL水平與治療前相比均顯著降低(P ＜0.05或 ＜0.01)，ALb水平與治療前相比顯著增加(P＜0.05);但2組治療后ALT、AST、TBiL和Alb水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。見(jiàn)表1。

表1 2組治療前后肝功能指標(biāo)比較n=50，±s

表1 2組治療前后肝功能指標(biāo)比較n=50，±s

注:與治療前比較，*P ＜0.05，#P ＜0.01

組別 ALT(U/L) AST(U/L) TBiL(g/L) ALb(μmol/L)對(duì)照組治療前 208±32 154±28 39±10 34±5治療后 39±7# 36±8# 15±4* 40±5*治療組治療前 210±31 158±31 39±9 32±4治療后 36±12# 32±6# 16±4* 38±6*

2.2 血清肝纖維化指標(biāo) 對(duì)照組治療后HA、LN、PC-Ⅲ和CⅣ水平較治療前無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);治療組治療后HA、LN、PC-Ⅲ和CⅣ水平與治療前相比均顯著降低(P ＜0.01)。治療組治療后HA、LN、PC-Ⅲ和CⅣ水平明顯低于對(duì)照組治療后，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)。見(jiàn)表2。

表2 2組治療前后血清肝纖維化比較n=50，±s

表2 2組治療前后血清肝纖維化比較n=50，±s

注:與治療前比較，*P ＜0.01;與對(duì)照組比較，#P ＜0.01

組別 HA(μg/L) LN(μg/L) PC-Ⅲ(ng/L) CⅣ(ng/L)對(duì)照組治療前 279±55 209±38 237±49 188±32治療后 269±32 191±36 218±43 186±37治療組治療前 280±31 211±48 234±41 186±30治療后 168±22*# 114±40*# 144±25*# 109±20*#

2.3 TGF-β1、IL-10 和 TNF-α 指標(biāo) 對(duì)照組治療后 TGF-β1、IL-10和TNF-α水平較治療前差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);治療組治療后HTGF-β1和TNF-α水平與治療前相比均顯著降低(P ＜0.05或＜0.01)，而IL-10水平與治療前相比顯著提高(P ＜0.05)。治療組治療后TGF-β1和TNF-α 水平明顯低于對(duì)照組治療后(P ＜0.05或＜0.01)，而IL-10水平明顯高于對(duì)照組治療后(P ＜0.05)。見(jiàn)表3。

表3 2組治療前后TGF-β1、IL-10和TNF-α比較n=50，±s

表3 2組治療前后TGF-β1、IL-10和TNF-α比較n=50，±s

注與治療前比較，*P ＜0.05，#P ＜0.01;與對(duì)照組比較，△P ＜0.05，☆P ＜0.01

組別 TGF-β1(mg/L) IL-10(μg/L) TNF-α(ng/L)對(duì)照組治療前 144±22 24±5 3.8±0.5治療后 137±16 22±4 3.7±0.3治療組治療前 147±32 25±5 3.9±0.7治療后 90±11#☆ 38±8＊△ 1.7±0.2＊△

2.4 Western blot法測(cè)CⅠ和CⅢ變化 對(duì)照組與治療組治療后CⅠ和CⅢ水平與治療前相比均顯著降低(P＜0.05或＜0.01);治療組治療后CⅠ和CⅢ水平明顯低于對(duì)照組治療后，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表4。

3 討論

本研究通過(guò)血清學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組和治療組治療后ALT、AST和TBiL水平降低，ALb水平顯著增加，提示兩種治療方法均有效的改善了肝功能。肝纖維化指標(biāo)顯示苦參素治療組HA、LN、PC-Ⅲ和CⅣ水平與治療前相比均顯著降低。而對(duì)照組治療后沒(méi)有顯著改變，暗示苦參素具有改善肝纖維化的功能。細(xì)胞因子檢測(cè)和免疫印跡結(jié)果顯示苦參素氯化鈉注射液降低TGF-β1、TNF-α、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原，升高IL-10了水平，提示苦參素改善肝纖維化的機(jī)制可能通過(guò)改變上述物質(zhì)而發(fā)揮作用。

表4 2組治療前后CⅠ和CⅢ與β-actin比值的比較n=10，±s

表4 2組治療前后CⅠ和CⅢ與β-actin比值的比較n=10，±s

注:與治療前比較，*P ＜0.05，#P ＜0.01;與對(duì)照組比較，△P ＜0.05

組別 CⅠ CⅢ對(duì)照組治療前 1.9786 ±0.1363 2.3123 ±0.1578治療后 1.6385 ±0.0876* 1.9543 ±0.1352*治療組治療前 1.9689 ±0.1478 2.3476 ±0.1842治療后 1.3572±0.1476#△ 1.4558±0.3756＊＊△

研究顯示，肝星狀細(xì)胞的激活認(rèn)為是肝纖維化過(guò)程中最重要的一步。HSC激活并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞，通過(guò)增生和分泌細(xì)胞外基質(zhì)參與肝纖維化的形成，因此各種致纖維化因素均把肝星狀細(xì)胞作為最終靶細(xì)胞，其中TGF-β1和TNF-α是有力的致纖維化因子，調(diào)控肝內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的合成與降解［3］。因此苦參素可以通過(guò)降低TGF-β1和TNF-α的合成而抑制肝星狀細(xì)胞的激活，起到抑制肝纖維化的作用。

細(xì)胞外基質(zhì)包括膠原、糖蛋白及蛋白多糖等，其中膠原是最主要的成分，在肝臟中有Ⅰ型，Ⅲ型-Ⅵ型共5型，而以Ⅰ型和Ⅲ型為主。肝纖維化早期膠原沉積以Ⅲ型為主，后期以Ⅰ型為主，因此本研究中通過(guò)免疫印跡觀察到的Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的降低進(jìn)一步證實(shí)苦參素抑制了肝星狀細(xì)胞的激活，降低了Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的合成，緩解了肝纖維化過(guò)程。此外，動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)IL-10有抑制Ⅰ型膠原表達(dá)，促進(jìn)膠原酶合成的作用，進(jìn)而影響細(xì)胞外基質(zhì)沉積，延緩肝纖維化進(jìn)程［4，5］，這與本實(shí)驗(yàn)觀察到的結(jié)果相一致，進(jìn)一步證實(shí)了苦參素的抗肝纖維化作用。

因此，本研究通過(guò)臨床實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)苦參素作為一種中藥提取劑能夠抑制肝星狀細(xì)胞的激活，降低TGF-β1、TNF-α、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原，升高IL-10了水平，緩解肝纖維化過(guò)程，為苦參素的臨床防治肝纖維化提供了新的理論依據(jù)。

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