卵巢癌組織中HE4表達(dá)及與其臨床病理因素的關(guān)系

王丹丹 李燕華 張 競(jìng)

卵巢癌(ovarian carcinoma)是女性生殖道常見的惡性腫瘤之一，盡管其發(fā)病率在女性生殖系統(tǒng)腫瘤中居第三位，但死亡率卻居第一位[1]。隨著宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌診斷和治療的不斷進(jìn)展，卵巢癌已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅女性生命的惡性腫瘤之一，并且卵巢癌發(fā)病率呈現(xiàn)逐年升高的趨勢(shì)[2]。大部分卵巢癌患者確診時(shí)已至晚期,僅有25%的患者早期被發(fā)現(xiàn)[1]，晚期卵巢癌患者5年生存率較早期患者低，約從95%降至20%～30%[3]。因此，許多學(xué)者正致力于尋找比CA125更為有效，更為敏感的腫瘤標(biāo)記物，應(yīng)用于卵巢癌的早期診斷中。

人附睪蛋白4(HE4，又名WFDC2)基因的cDNA最早由Kichhoff等[4]首先從附睪的上皮遠(yuǎn)端分離出來，是1種可能與精子成熟度有關(guān)的蛋白酶抑制劑。HE4基因位于染色體20q12～13.1上，全長(zhǎng)為12 kb左右，由5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子組成[5]，HE4的功能尚不確定。目前已有大量研究表明HE4在卵巢癌早期診斷中的價(jià)值明顯優(yōu)于CA125[6～11]。

目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于HE4在卵巢癌中的相關(guān)研究大多集中于血清學(xué)方面，而有關(guān)組織中HE4表達(dá)情況的研究較少。本研究采用免疫組織化學(xué)技術(shù)，檢測(cè)正常卵巢組織、上皮性卵巢良性腫瘤組織及卵巢癌組織中HE4陽(yáng)性表達(dá)及其與卵巢癌臨床分期、細(xì)胞分化及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。探討HE4在卵巢癌組織中的表達(dá)情況及其與卵巢癌發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移的關(guān)系，從而為卵巢癌的診療及評(píng)估預(yù)后提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本

標(biāo)本來源于2008年1月～2010年7月蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤婦科收治的87例患者；包括首次治療(術(shù)前未行放、化療)并行手術(shù)切除的卵巢癌患者47例，上皮性卵巢良性腫瘤20例(漿液性囊腺瘤14例、黏液性囊腺瘤6例)，同時(shí)選取20例正常卵巢組織作為對(duì)照。所選病例均有完整臨床資料及存檔蠟塊。隨訪截止日期為2011年11月，隨訪時(shí)間為7～46個(gè)月。

1.2 臨床資料

47例卵巢癌患者，年齡30～68歲，平均年齡52.25歲，≥52歲30例，<52歲17例；非卵巢癌患者年齡15～77歲，平均年齡39.29歲。根據(jù)UICC 2002版PTNM病理分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期，早期(FIGOⅠ/Ⅱ期)卵巢癌28例，中、晚期(FIGO Ⅲ/Ⅳ期)卵巢癌19例；高分化20例，中、低分化27例；術(shù)后經(jīng)病理檢查證實(shí)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者29例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者18例。上皮性卵巢癌患者術(shù)前3個(gè)月內(nèi)均未接受任何激素治療，未行化療或放療。復(fù)閱上述患者的病理切片，選取存檔標(biāo)本石蠟塊進(jìn)行切片，厚度4 μm。

1.3 試劑

鼠抗人HE4多克隆抗體，購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。S-P免疫組化試劑盒(通用型二步法試劑盒)，購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。試劑盒組成：試劑(無色液體)，3%去離子水過氧化氫溶液6 ml；試劑A(無色液體)，封閉用正常山羊血清工作液6 ml；試劑B(黃色液體)，生物素標(biāo)記兔抗山羊IgG二抗工作液6 ml；試劑C(橙色液體)，辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液(S -A/HRP)6 ml。DAB Kit(20 X ) (ZLI-9032)，購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。包括試劑A：濃縮緩沖液(20 X) 3 ml；試劑B：濃縮DAB溶液(20 X) 3 ml；試劑C：濃縮過氧化氫溶液(20 X) 3 ml。

1.4 主要儀器設(shè)備

切片機(jī)(德國(guó)Leitz產(chǎn)1512型)；攤片、烤片機(jī)(湖北孝感產(chǎn)CS-D型)；隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海市醫(yī)療器械廠產(chǎn)品)；微波爐(日本松下)；顯微鏡(日本Olympus)；顯微攝影顯微鏡(日本 Olympus)。

1.5 方法

1.5.1 載玻片處理 取玻片200張，置清潔液中浸泡14 h。取出玻片用自來水沖洗后，置60℃烤箱中烘干備用。

1.5.2 標(biāo)本切片制備 標(biāo)本均用術(shù)后10%福爾馬林液固定，常規(guī)石蠟包埋。每例蠟塊連續(xù)切片3張，厚4～5 μm，二甲苯脫蠟，無水乙醇脫水，放入60℃烤箱中至少2 h以上。1張行HE染色，其余2張備染。

1.5.3 S-P法染色步驟 石蠟切片經(jīng)水化后，用PBS(pH 7.4)沖洗3 min×3次。每張切片加一滴過氧化物酶抑制劑，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，室溫下孵育20 min。抗原修復(fù)：將標(biāo)本放置在修復(fù)液(枸櫞酸鹽緩沖溶液pH 6.0，95℃，10 min)中，用微波爐高火加熱10 min，室溫下自來水冷卻10 min。PBS沖洗3 min×3次。去除PBS液，每張切片加1滴非免疫性動(dòng)物血清，室溫下孵育20 min，減少非特異性背景，不必沖洗，吸去多余血清。每張切片加1滴一抗，4℃冰箱中過夜。PBS沖洗3 min×3次。去除PBS液，每張切片加1滴生物素標(biāo)記的二抗，室溫下孵育20 min。PBS沖洗3 min×3次。去除PBS液，每張切片加1滴鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶溶液。室溫下孵育20 min。PBS沖洗3 min×3次。去除PBS液，每張切片加2滴新鮮配置的DAB溶液，顯微鏡下觀察3～10 min，陽(yáng)性染色為棕黃色。顯色完成后，自來水沖洗，蘇木精復(fù)染，酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行，陽(yáng)性對(duì)照片由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供，陰性對(duì)照片除用PBS代替一抗外，其余步驟相同。

1.6 判斷標(biāo)準(zhǔn)

實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均由我院病理科資深醫(yī)師，在相同條件下觀察每張切片并作出判斷。HE4免疫組化陽(yáng)性染色為腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒或團(tuán)塊。判斷方法：采用二次計(jì)分法，每例標(biāo)本隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野(×400)，計(jì)數(shù)每個(gè)高倍視野中陽(yáng)性細(xì)胞百分比并計(jì)分。首先按染色強(qiáng)度計(jì)分：0分為無色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。再按陽(yáng)性細(xì)胞百分比計(jì)分，0分為陰性，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<10 %為1分，11 % ～ 50%為2分， 51% ～ 75 %為3分， >75 %為4分。上述兩項(xiàng)得分的乘積作為最終結(jié)果，積分≤ 2為陰性表達(dá)，>2為陽(yáng)性表達(dá)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用χ2檢驗(yàn)及相關(guān)分析的方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果

2.1 正常卵巢、上皮性卵巢良性腫瘤及卵巢癌組織中HE4表達(dá)情況

HE4主要表達(dá)于卵巢上皮組織細(xì)胞胞質(zhì)中，細(xì)胞核不著色，鏡下可見胞質(zhì)中棕黃色顆粒均勻分布或粗細(xì)不等散在分布。正常卵巢組織中HE4蛋白表達(dá)陽(yáng)性率為0(0/20)，上皮性卵巢良性腫瘤組織中其表達(dá)陽(yáng)性率為10.0%(2/20)，卵巢癌組織中其表達(dá)陽(yáng)性率為74.5%(35/47)。三組間兩兩比較顯示，卵巢癌組織其陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于正常卵巢組織和卵巢良性腫瘤組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)。正常卵巢組織與卵巢良性腫瘤組織HE4表達(dá)陽(yáng)性率比較無明顯差別，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 3種組織中HE4表達(dá)情況(例)

注：△為與正常卵巢組織比較；※為與卵巢良性腫瘤組織比較；☆為與卵巢癌組織比較

2.2 HE4表達(dá)與卵巢癌臨床病理因素的關(guān)系

HE4表達(dá)陽(yáng)性率中、晚期(Ⅲ/Ⅳ期)卵巢癌者顯著高于早期(Ⅰ/Ⅱ期)者(P<0.01)；中、低分化者其表達(dá)陽(yáng)性率顯著高于高分化者(P<0.05)；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者其表達(dá)陽(yáng)性率也顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P<0.05)；HE4表達(dá)陽(yáng)性率與卵巢癌患者年齡無關(guān)(P>0.05)，見表2。

表2 HE4表達(dá)與卵巢癌臨床病理因素的關(guān)系(例)

3 討論

3.1 HE4的生物學(xué)特性

HE4(human epididymis gene produet4)，人附睪蛋白4，其基因[5]位于染色體20q12～13.1上，全長(zhǎng)為12 kb左右，由5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子組成，并存在多種剪切方式，其編碼的小分子分泌型蛋白與細(xì)胞外蛋白酶抑制劑有很高的同源性，從蛋白結(jié)構(gòu)上講是1種由乳清酸性蛋白(WAP-type fourdisulphide core protein,WFDC)基因編碼的相對(duì)分子質(zhì)量是3 kD的分泌型糖蛋白，是蛋白酶抑制劑家族(具有保護(hù)性免疫作用)中的一員,該基因有多種剪切方式，可以編碼分泌小分子量的蛋白[12]。HE4 的生物學(xué)功能尚不清楚，它是否同家族中的蛋白酶抑制因子一樣具有蛋白水解酶抑制作用，還有待進(jìn)一步研究證明。生物信息學(xué)分析結(jié)果提示：HE4基因的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)位于翻譯起始密碼子ATG上游-28位C，HE4基因的啟動(dòng)子中沒有經(jīng)典的TATA box和CCAAT box，該啟動(dòng)子可能是1個(gè)TATA-less啟動(dòng)子[13]。趙瑩珺等[14]利用轉(zhuǎn)染和熒光素酶報(bào)告基因等方法對(duì)人HE4 基因啟動(dòng)子區(qū)開展了系統(tǒng)的分析，闡明了HE4基因的轉(zhuǎn)錄活性主要是由轉(zhuǎn)錄因子Sp1 與位于-71和-48的Egr-1位點(diǎn)結(jié)合所介導(dǎo)。在轉(zhuǎn)錄調(diào)控層面上進(jìn)一步論證了HE4在卵巢癌組織中的高表達(dá)，有望被論證為1種高靈敏度和特異性的卵巢癌標(biāo)志物，也為HE4在卵巢癌靶向性基因治療中提供了一定的理論依據(jù)，HE4基因有望成為控制腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移及治療腫瘤的新靶點(diǎn)，為卵巢癌的治療開辟了新途徑。

3.2 HE4在卵巢癌組織中的表達(dá)

目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于HE4在卵巢癌中的相關(guān)研究大多集中于血清學(xué)方面，而關(guān)于組織中HE4表達(dá)情況的研究較少。目前報(bào)道[15～19]顯示HE4在93%漿液性卵巢癌和100%子宮內(nèi)膜樣卵巢癌中呈高表達(dá)，在透明細(xì)胞癌組織中僅有50%的陽(yáng)性表達(dá)率，黏液性腫瘤組織中未見表達(dá)，且在肺癌、肝癌、腎癌、甲狀腺癌等中亦未見表達(dá)，HE4 是目前診斷卵巢癌靈敏度最高的腫瘤標(biāo)志物。Hellstrom等[20]比較了卵巢癌患者及正常人血清中 HE4 蛋白含量，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)卵巢癌患者血清中 HE4 蛋白表達(dá)明顯增高，提示該基因可能是1個(gè)卵巢癌相關(guān)基因。Drapkin等[15]還應(yīng)用 RT-PCR技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，HE4 在卵巢惡性腫瘤細(xì)胞系中呈高表達(dá)，細(xì)胞培養(yǎng)液中含有分泌型 HE4，這與最近在血循環(huán)中發(fā)現(xiàn) HE4的報(bào)道相一致，這些結(jié)果提示，HE4 具有作為腫瘤標(biāo)志物的前提條件。本研究結(jié)果顯示，HE4主要表達(dá)于卵巢癌組織上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒或團(tuán)塊。HE4在正常卵巢組織、卵巢良性腫瘤組織中不表達(dá)或部分表達(dá)，在卵巢癌組織中其表達(dá)明顯升高(74.5%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果提示HE4高表達(dá)與卵巢癌密切相關(guān)，大量表達(dá)的HE4可能通過某種機(jī)制，促進(jìn)了卵巢上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。

3.3 HE4表達(dá)與卵巢癌臨床病理因素的關(guān)系

有研究表明[21]HE4表達(dá)與卵巢癌臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均存在明顯相關(guān)性，HE4表達(dá)水平隨臨床分期進(jìn)展、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移而升高。管桂峰等[22]在研究中發(fā)現(xiàn)HE4蛋白在卵巢癌組織中的表達(dá)與腫瘤分期呈正相關(guān)，即晚期卵巢癌患者血清HE4水平高于早期卵巢癌。Havrilesky等[23]研究結(jié)果也表明，HE4在卵巢癌不同期別中的敏感性不同，Ⅰ/Ⅱ和Ⅲ/Ⅳ期中的敏感性分別為62.4%～82.7%和74.6%～92.5%。本研究結(jié)果顯示，早期(Ⅰ/Ⅱ期)卵巢癌組織中HE4表達(dá)陽(yáng)性率(57.1%)明顯低于中、晚期(Ⅲ/Ⅳ期)卵巢癌組織(89.5%)。本研究還顯示卵巢癌高分化者HE4表達(dá)陽(yáng)性率(65.0%)明顯低于中、低分化者(92.6%)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。范玉平等[24]研究顯示，HE4 表達(dá)水平隨臨床分期的增高而增高，Ⅰ期與Ⅲ/Ⅳ期比較有顯著性差異，與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果相一致。可見HE4表達(dá)隨著卵巢癌的臨床分期、細(xì)胞分化的升高而升高。本研究結(jié)果亦顯示，在卵巢癌組織中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組HE4表達(dá)水平(72.4%)明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(38.9%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；郭冰沁等[25]研究得出：HE4陽(yáng)性表達(dá)率隨著卵巢癌的病理分級(jí)增高而顯著增高，臨床分期愈晚表達(dá)率愈高，有腹腔器官及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者明顯高于無轉(zhuǎn)移者，與本研究結(jié)果一致。Kamei等[26]應(yīng)用免疫組化和RT-PCR技術(shù)，分析了120例接受了手術(shù)治療的乳腺癌患者，發(fā)現(xiàn)120例患者中71例患者均表達(dá)HE4 mRNA和HE4蛋白，HE4表達(dá)與臨床病理因素?zé)o相關(guān)性，但與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。HE4表達(dá)陽(yáng)性組5年無病生存率明顯低于HE4陰性組。數(shù)據(jù)表明，HE4表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，可能是乳腺癌復(fù)發(fā)的一個(gè)預(yù)測(cè)指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)亦得出HE4與卵巢癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。由此我們推測(cè)HE4可能通過某種機(jī)制參與了卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移，由于目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于HE4作用機(jī)制的報(bào)道甚少，故具體機(jī)制目前還在進(jìn)一步研究中。另外本研究還顯示HE4陽(yáng)性表達(dá)與卵巢癌患者年齡(≤52歲和>52歲)無關(guān)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上所述，HE4蛋白作為1種新型的腫瘤標(biāo)志物正引起越來越多研究者的關(guān)注，其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后方面的作用不斷被發(fā)現(xiàn)，但是有關(guān)HE4蛋白的作用機(jī)制、作用細(xì)節(jié)及受調(diào)節(jié)的因素等研究甚少，還有很多功能仍未被發(fā)現(xiàn)，HE4與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移的關(guān)系尚需要進(jìn)一步探討。

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