協同刺激分子B7-H4 在卵巢癌中的研究進展

徐 梅綜述 吳昌平 蔣敬庭審校

卵巢癌位于盆腔，由于缺乏早期臨床癥狀及有效的診斷方法，大約70%的患者就診時已屬于晚期，其5年存活率不足30%[1,2]，若能早期診斷，其5年存活率將增加至80%[2]。

B7-H4是B7家族的1個新成員，能通過抑制細胞的增殖、阻礙細胞因子的產生和細胞周期的進程負性調控T細胞免疫應答[3～5]。大量的研究發現B7-H4分子在許多惡性腫瘤中高表達，并與腫瘤的發生、發展和預后相關[3,4,6～11]。B7-H4在卵巢癌組織中的過表達使之有望成為新的腫瘤標志物，作為卵巢癌早期診斷指標及免疫治療新靶點[12～16]。

1 B7-H4

1.1 B7-H4分子的結構與生物學功能

機體抗腫瘤免疫功能主要由T細胞免疫介導，而T細胞的活化需要雙重信號的誘導，即MHC-TCR抗原提呈信號和協同刺激信號。已發現的協同刺激分子包括B7/CD28超家族、TNF/TNFR超家族、CD2超家族以及部分整合素，相互之間具有完全不同或部分重疊的生物學功能[17]。B7/CD28家族是重要的協同刺激分子，已被鑒定的B7家族成員有B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、B7-DC(PD-L2、CD273)、B7-H1(PD-L1、CD274)、B7-H2(ICOSL、CD275)、B7-H3(CD276)、B7-H4(又稱 B7S1 和 B7x，[4,18～20]、B7S3[21]和 B7-H6[22]。它們不僅提供了在啟動、增強和維持T細胞應答中關鍵性的正性信號，而且還可提供重要的負性信號來限制、終止或消弱T細胞的免疫應答[4,23,24]。

B7-H4又稱B7S1和B7x，是2003年研究[20,25,26]確定屬于B7家族的1個新成員。研究[27]發現人B7-H4的基因定位于人染色體1p11.1，跨度為66 kb，其中外顯子6的功能是選擇性剪接，可調節生成2種不同的轉錄物。而且在人染色體20p11.1存在1個B7-H4假基因，在編碼區僅含有1個外顯子和2個終止密碼子，與編碼B7-H4的cDNA在核酸水平的相似性高達94%。小鼠的B7-H4分子定位于小鼠3號染色體上，有6個編碼區,在蛋白結構上與人B7-H4同源性高達87%。

2005年，Salceda等[13]首次在卵巢癌及乳腺癌cDNA中鑒定出DD-O110基因，并發現DD-O110 cDNA編碼1個Ⅰ型跨膜糖蛋白，經鑒定DD-O110即B7-H4。這個基因編碼含有282個氨基酸的信號序列，包括1個信號序列、1個免疫球蛋白功能區和1個-COOH末端疏水性跨膜區[14,20]。研究者認為B7-H4分子是通過糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定在細胞膜上[20]。Carreno和Watanabe等[18,28]推測B7-H4受體為B和T淋巴細胞衰減因子(B and T lymphocyte attenuator，BTLA)。該受體為胞內尾段具有2個免疫受體酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifs ITIM)的免疫球蛋白。它在初始T細胞(naive T cell,Tn)及效應性Th2細胞不表達，而表達于效應性Th1細胞上，該分子與抗原受體交聯能使其胞內區的ITIM中的酪氨酸殘基磷酸化啟動酶促級聯反應，進而下調T細胞增殖反應，抑制細胞因子IL-2的分泌，認為BTLA是類似CTLA-4 和PD-1的抑制性受體。

1.2 B7-H4分子在體內的表達和分布

B7-H4 mRNA表達于專職抗原遞呈細胞(antigen-presenting cells ，APC)，廣泛分布于人的正常外周非淋巴組織如肺、小腸、胎盤、肝、骨骼肌、腎、胰腺、前列腺、卵巢等[20,25,27]，然而對人B7-H4特異性單克隆抗體進行免疫組化，結果顯示正常來源的上述組織均陰性表達，而B7-H4可表達于人類一些惡性腫瘤組織。研究表明正常外周組織能在轉錄水平對B7-H4的表達進行嚴密地調控[20,24,26,27]。一些學者[14,29]認為B7-H4定位于腫瘤細胞膜，而Salceda等[13]實驗顯示B7-H4不僅表達于腫瘤細胞的胞膜而且表達于胞質，Kryczek等[30]則認為其定位于卵巢癌細胞內，而在腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophages，TAM)僅定位于包膜。在腫瘤患者的血漿[6,14,29,31]及腹腔積液[14]中亦可檢測到較高水平可溶性B7-H4(sB7-H4)。流式細胞術(fluorescence activated cell sorter，FACS)分析顯示，新鮮分離的T細胞、B細胞、單核細胞、樹突狀細胞表面無B7-H4分子表達，但在體外能被IL-6和IL-10誘導表達[20,25,27]。

1.3 B7-H4分子的作用機制

大量研究表明，B7-H4具有負性調控T細胞的免疫應答作用，通過抑制CD4+T細胞和CD8+T細胞的增殖、抑制細胞因子IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ的產生，阻斷細胞周期使T細胞停滯在G0/G1期[13,20,25～27]。B7-H4的高表達可以保護表皮細胞免于失巢凋亡，促進上皮細胞的惡性轉化[13]，并能通過抑制嗜中性粒細胞的產生而調節固有免疫[4,32]。研究表明B7-H4分子是T細胞1個強有力的減弱因子，在下調組織特異性免疫和腫瘤免疫逃逸機制中發揮重要作用。

CD4+CD25+調節性T(regulatory T,Treg)細胞是1種免疫抑制性細胞，占CD4+T細胞的5%～10%。Kryczek等[33]發現Treg細胞能刺激APC分泌IL-6和IL-10，在IL-6和IL-10的作用下APC表達B7-H4，進而發揮免疫抑制效應。事先阻斷B7-H4可下調Treg對APCs介導的免疫抑制活性。粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)和IL-4則可以抑制APC表達B7-H4。然而，IL-6、IL-10、GM-CSF、IL-4不能對腫瘤細胞中B7-H4 mRNA和蛋白的表達進行調控，表明腫瘤細胞表達B7-H4的調控機制和APC有所不同。他們[30]還發現抑制腫瘤相關抗原特異性T細胞效應的是B7-H4陽性TAM，而不是B7-H4陽性卵巢癌細胞。Kryczek等[34]進一步研究發現B7-H4陽性TAM的數量與Treg細胞的數量呈顯著正相關，并且卵巢癌患者的預后與Treg細胞和B7-H4陽性TAM的數量呈負相關，而與B7-H4陽性卵巢癌細胞表達量無關。而Chen等[29]通過體內實驗發現肺癌細胞膜B7-H4的表達隨著腫瘤的進展而增加，若增加TAM可顯著增強這種效應，而B7-H4 mAb可明顯抑制腫瘤的生長。體外實驗發現B7-H4陽性肺癌細胞可明顯抑制T細胞增殖效應，認為是TAM誘導肺癌細胞B7-H4表達，進而通過抑制T細胞增殖效應而促進腫瘤的生長。

目前對B7-H4分子介導的信號通路尚不清楚。Wang等[35]用B7-H4 Ig融合蛋白作用于CD3+表達B7-H4的鼠T細胞，可抑制TCR/CD28信號轉導，包括MAP激酶，ERK，p38及JNK的磷酸化。同時也包括AKT激酶的磷酸化，通過內生性GSK-3的磷酸化削弱其酶的活性。相反，TCR相鄰的酪氨酸激酶ZAP70和淋巴細胞特異性酪氨酸蛋白激酶(lymphocyte-specific protein tyrosine kinase，LCK)的磷酸化狀態并沒有因此而改變。因此推測B7-H4是通過干擾ERK、JNK和AKT的激活，而不是通過干擾ZAP70或LCK的激活來抑制T細胞增殖和IL-2分泌。

2 B7-H4分子在卵巢癌中的表達及臨床意義

CA125是上皮源性卵巢癌傳統的血清學及組織學標志物，對早期卵巢癌診斷的敏感性為27%～66%[36]。在良性卵巢腫瘤、盆腔炎癥、腸癌、輸卵管腺癌、子宮內膜癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌和肺癌等疾病中CA125也會升高[2,31]，故其不能作為卵巢癌診斷的金指標。因而尋找1種特異性強、靈敏性高的生物指標或聯合幾種標志物的檢測對卵巢癌早期診斷與治療具有極為重要的意義。

Salceda等[13]用定量多聚酶鏈反應(QPCR)分析13例不同病理類型的卵巢癌和13例正常卵巢組織，結果顯示，B7-H4 mRNA在87.5%的卵巢漿液性乳頭狀腺癌組織中高表達，比正常卵巢組織中B7-H4 mRNA的平均水平高出至少2倍。而另外5例黏液性卵巢癌和交界性卵巢癌組織中B7-H4 mRNA的表達水平與正常卵巢組織相當，因此認為B7-H4 mRNA在卵巢癌中的表達具有組織特異性并定位于包膜。Tringler等[16]研究發現B7-H4在所有原發卵巢漿液性癌(32例)、內膜樣癌(12例)、透明細胞癌(15例)、所有轉移漿液性癌(23例)和轉移性內膜樣癌(7例)中100%表達，但在11例黏液性癌中僅1例表達。

Simon等[14]利用敏感的雙克隆ELASA夾心法研究2500余例卵巢癌患者的血清、腹腔積液及腫瘤組織溶解物中B7-H4的表達情況，結果顯示，B7-H4蛋白在卵巢癌組織溶解物中高表達。血清標本中均可檢測出低濃度的B7-H4蛋白，但與健康人和良性卵巢腫瘤相比，卵巢癌患者的血清標本中B7-H4的表達顯著升高，特別是子宮內膜樣癌、漿液性癌高于黏液性癌。他們[37]還通過檢測B7-H4和CA125在251例卵巢癌患者卵巢組織溶解物中的表達情況，發現B7-H4在卵巢癌Ⅰ期患者中有48%、Ⅱ期患者有55%過表達，而晚期患者表達高達67%，B7-H4表達水平越高患者預后越差。與之相比，CA125在早期患者僅31%升高。而且，在30例沒有CA125表達的早期卵巢癌中卻有B7-H4的表達。B7-H4聯合CA125檢測診斷早期卵巢癌陽性率可增至65%。Simon等[31]進一步分析68例卵巢癌(16例早期，52例晚期)、108例正常對照組和20例健康婦女血清標本中CA125、B7-H4、Spondin2、DcR3的表達水平，結果顯示B7-H4特異性最高，CA125次之。

骨橋蛋白(osteopontin，OPN)是1種具有多種功能的分泌性磷酸化糖蛋白，可促進細胞的黏附和遷移，被認為是惡性轉化的分泌性蛋白，其過度表達與腫瘤細胞生長、增殖和侵襲、轉移密切相關。Zhang等[8]采用免疫組化法檢測15例正常卵巢組織、20例卵巢良性腫瘤組織、20例卵巢交界性腫瘤組織、40例卵巢癌組織標本中OPN和B7-H4的表達情況，結果顯示：OPN和B7-H4在上皮性卵巢癌組織中的表達高于卵巢交界性及良性、正常卵巢組織；OPN和B7-H4在低分化卵巢癌中的陽性率均顯著高于高、中分化卵巢癌，Ⅲ～Ⅳ期卵巢癌中的陽性率亦顯著高于Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌；B7-H4在卵巢漿液性癌中的陽性率顯著高于黏液性癌；顯示B7-H4在卵巢癌中表達具有組織特異性。因此認為，B7-H4分子可作為卵巢癌特別是漿液性卵巢癌新的生物學指標，可作為早期卵巢癌的1個重要診斷標志物，是CA125檢測早期卵巢癌的很好補充。

綜上所述，B7-H4分子是最近發現的T細胞共刺激分子B7家族的新成員，其在發病率高且預后差的漿液性卵巢癌中高表達，預示B7-H4會是1個具有極大應用前景的新的腫瘤標志物，聯合檢測有助于卵巢癌的早期診斷。以B7-H4為靶點抑制B7-H4陽性的TAM活性將會是卵巢癌免疫治療中增強T細胞免疫的1個新策略。但是B7-H4蛋白的信號調節通路及其受體目前還不確定，深入研究其確切的作用機制，可為卵巢癌的診治提供新的策略。

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