VEGF-C及癌周淋巴管密度與頭頸鱗癌頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

鄧蒞霏 齊淑軼 劉學(xué)明 石冬梅 高 文

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是包括頭頸鱗癌(HNSCC)在內(nèi)的大多數(shù)惡性腫瘤的主要轉(zhuǎn)移途徑，是影響患者預(yù)后的重要因素之一。淋巴管的生成被認(rèn)為是癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移至區(qū)域淋巴結(jié)關(guān)鍵所在。血管內(nèi)皮生長因子C(vascular endothelial growth factors C，VEGF-C)是特異性的淋巴管生長因子，與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)；而淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞透明質(zhì)酸受體-1(LYVE-1)則是新發(fā)現(xiàn)的特異性淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物。本研究采用免疫組化法，檢測HNSCC癌組織中VEGF-C表達(dá)情況及癌周組織中LYVE-1表達(dá)，并對淋巴管密度(lymphatic vessel density，LVD)進(jìn)行計(jì)數(shù)，探討淋巴管生成與頭頸鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集2005年6月～2009年2月本院收治的頭頸鱗癌手術(shù)蠟塊標(biāo)本104例，所有病例為初治患者，術(shù)前未進(jìn)行放化療，臨床病理資料完整，其中男性79例，女性25例，年齡33～75歲，中位年齡51歲。口腔癌37例，喉癌53例，下咽癌14例。腫瘤TNM分級、臨床分期等均根據(jù)2002年版UICC標(biāo)準(zhǔn)而定，頸部淋巴結(jié)狀態(tài)的判定，根據(jù)文獻(xiàn)[1，2]分為臨床陰性(cN0)、臨床陽性(cN+)，病理陰性(pN0)、病理陽性(pN+)。 T129例、T241例、T320例、T414例；Ⅰ期25例、Ⅱ期31例、Ⅲ期34例、Ⅳ期14例；cN0 71例、cN+ 33例，pN0 58例、pN+ 46例。病理類型均為鱗癌。組織學(xué)分化程度：高分化49例，中分化35例，低分化20例。另選取20例口腔、咽喉良性病變作為對照組。

1.2 免疫組化染色

蠟塊行4 μm厚切片，免疫組化SP法檢測LYVE-1、VEGF-C的表達(dá)，兔抗人淋巴管內(nèi)皮透明質(zhì)酸受體-1(LYVE-1)抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，兔抗人VEGF-C多克隆抗體及通用型SP試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)有限公司，以試劑公司提供的陽性切片作為陽性對照，用PBS 替代一抗作為陰性對照，DAB顯色，蘇木精復(fù)染。

1.3 免疫組化染色結(jié)果判定

由兩位病理醫(yī)生在雙盲狀態(tài)下對免疫組化染色結(jié)果進(jìn)行評價。

LVD計(jì)數(shù)：每例腫瘤標(biāo)本均對癌周及癌內(nèi)的淋巴管進(jìn)行計(jì)數(shù)，參照文獻(xiàn)[3]確定癌周和癌內(nèi)的具體范圍。將LYVE-1呈棕黃色染色的內(nèi)皮細(xì)胞簇或內(nèi)皮細(xì)胞形成的條狀、隙狀結(jié)構(gòu)及有管腔者作為一個淋巴管計(jì)數(shù)。具體參照Weidner[4]推薦的方法：首先在低倍鏡(×20)下瀏覽切片，選擇淋巴管著色最為密集的3個區(qū)域(hot spot)，然后在高倍鏡(×40)下隨機(jī)計(jì)數(shù)被染色的淋巴管數(shù)目，取3個高倍鏡視野下淋巴管數(shù)目的均值作為微淋巴管密度(LVD)值。

VEGF-C表達(dá)：VEGF-C蛋白陽性表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，呈棕黃色顆粒樣物，參照文獻(xiàn)[5]，陽性細(xì)胞數(shù)≤10%為陰性(-)，>10%為陽性(+)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 VEGF-C表達(dá)與頭頸鱗癌臨床病理特征的關(guān)系

VEGF-C蛋白在正常組織及癌組織中陽性表達(dá)率分別為0(0/20)、74.04%(77/104)，P<0.05(χ2=39.067)。VEGF-C表達(dá)與腫瘤頸部淋巴結(jié)狀態(tài)及臨床分期有關(guān)，而與腫瘤組織學(xué)分化程度及腫瘤大小(T分期)無關(guān)，見表1。

2.2 頭頸鱗癌癌周組織中LYVE-1表達(dá)及LVD計(jì)數(shù)

癌周、癌內(nèi)組織及正常黏膜組織中均可見LYVE-1陽性表達(dá)，淋巴管管壁較薄，形態(tài)不規(guī)則，管腔呈擴(kuò)張或塌陷狀。癌周LVD明顯大于癌內(nèi)及正常黏膜組織，癌周LVD與腫瘤頸部淋巴結(jié)狀態(tài)、臨床分期及VEGF-C表達(dá)均相關(guān)，而與腫瘤組織學(xué)分化程度、腫瘤大小(T分期)無關(guān)，見表2。

表1 VEGF-C表達(dá)與頭頸鱗癌臨床病理因素的關(guān)系(例)

表2 癌周LVD與頭頸鱗癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

3 討論

頭頸鱗癌經(jīng)根治性手術(shù)和放射治療后總的5年生存率約在50%左右，其中頸部淋巴結(jié)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移是治療失敗的主要原因之一，因而評估原發(fā)腫瘤的轉(zhuǎn)移潛能及頸部淋巴結(jié)狀態(tài)一直是頭頸鱗癌治療中極其重要的環(huán)節(jié)。各種癌細(xì)胞經(jīng)淋巴道轉(zhuǎn)移的基本過程為癌細(xì)胞在原發(fā)灶的快速生長并從原發(fā)灶脫落，浸潤侵入毛細(xì)淋巴管，運(yùn)行到區(qū)域淋巴結(jié)內(nèi)大量增殖從而形成新的轉(zhuǎn)移灶，而癌周毛細(xì)淋巴管的增殖與擴(kuò)張則是腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移過程的必要條件，了解腫瘤及其周圍淋巴管的生成狀態(tài)對于掌握其轉(zhuǎn)移規(guī)律具有重要意義[6]。

由于缺乏可靠的淋巴管內(nèi)皮標(biāo)記物，長期以來對腫瘤淋巴管生成的研究進(jìn)展緩慢。1999年Banerji等[7]發(fā)現(xiàn)的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞透明質(zhì)酸受體(LYVE-1)作為目前特異性最強(qiáng)的淋巴管標(biāo)志物之一，使淋巴管的識別變得簡單而準(zhǔn)確，也使得腫瘤淋巴管生成的深入研究成為可能。

Tanigawa等[8]早在1981年就應(yīng)用染料示蹤技術(shù)，對人與動物腫瘤的淋巴管進(jìn)行研究，顯示實(shí)體瘤內(nèi)無淋巴管存在。Leu等[9]和Padera等[10]也均在對動物腫瘤淋巴管的研究中觀察到腫瘤內(nèi)部缺乏功能性淋巴管或淋巴管呈塌陷狀而無引流作用，而腫瘤周邊距正常組織100 μm的范圍內(nèi)則可見形態(tài)接近正常或擴(kuò)張的功能性淋巴管。以LYVE-1為淋巴管標(biāo)記物，對子宮內(nèi)膜癌和肺癌的研究[11]顯示，腫瘤組織中缺乏淋巴管網(wǎng)，淋巴管的生成主要發(fā)生在腫瘤浸潤前沿及腫瘤周圍，腫瘤的淋巴道播散則通過癌細(xì)胞向癌周淋巴管的侵入而實(shí)現(xiàn)。近年來，有關(guān)胃癌[3]、乳腺浸潤性導(dǎo)管癌[12]、子宮內(nèi)膜癌[13]及甲狀腺乳頭狀癌[14]的臨床研究均顯示，癌周淋巴管密度(peritoumoral lymphatic vessel density，PLVD)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，且是影響預(yù)后的獨(dú)立危險因素。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，頭頸鱗癌PLVD明顯高于正常組織及癌內(nèi)組織，與腫瘤分期及頸部淋巴結(jié)狀況有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的相關(guān)性，與以上的研究結(jié)果一致，說明多數(shù)惡性腫瘤的癌周淋巴管形態(tài)、數(shù)目的改變與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

VEGF-C是特異性的淋巴管內(nèi)皮生長因子，主要由腫瘤細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞分泌，經(jīng)自分泌或旁分泌形式作用于其受體VEGFR-3，通過一系列細(xì)胞信號通路的激活，使淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞存活期延長，促進(jìn)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞分化、增殖和遷移，在腫瘤的淋巴管生成中起重要作用[5]。研究表明VEGF-C與人類原發(fā)性實(shí)性腫瘤轉(zhuǎn)移能力之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的相關(guān)性，如鼻咽癌[15]、乳腺癌[5]和非小細(xì)胞肺癌[16]等。在關(guān)于胃癌[3]和非小細(xì)胞肺癌[16]的臨床病理研究還發(fā)現(xiàn)，VEGF-C高表達(dá)者其癌周LVD及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生率均相應(yīng)增高，且在胃癌中，VEGF-C高表達(dá)者無復(fù)發(fā)生存期及總生存期也明顯短于低表達(dá)者。就頭頸鱗癌而言，文獻(xiàn)報(bào)道[15，17]和本研究結(jié)果均表明，VEGF-C陽性表達(dá)與頸部淋巴結(jié)狀態(tài)、臨床分期密切相關(guān)。我們的結(jié)果還顯示，VEGF-C陽性表達(dá)與較高的癌周LVD具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的相關(guān)性，再次印證了VEGF-C具有刺激腫瘤淋巴管生成的作用。

綜上，我們認(rèn)為頭頸鱗癌的VEGF-C表達(dá)及癌周LVD與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，對臨床判斷腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移潛能具有一定的參考價值。對兩者的檢測，有助于患者的預(yù)后判斷及治療方案的評價。

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