Bag-1和 Caspase-3 在大腸癌中的表達(dá)及臨床意義

劉 軒 李 榮 郭守俊 曾紅學(xué)

大腸癌是消化系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。在我國(guó)，大腸癌居消化道腫瘤第2位[1]。大腸癌的發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化及異常過(guò)度增殖有關(guān)，也與細(xì)胞凋亡的減少有關(guān)。Bcl-2 結(jié)合抗凋亡基因 1(Bcl-2 associated athanogene-1，Bag-1)是1種抗凋亡基因[2]，主要通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，但其抗凋亡作用機(jī)制尚不明確[3]。Caspase-3是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的重要的關(guān)鍵因子，直接或間接參與了多種因素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[4]。目前在國(guó)內(nèi)，有關(guān)Bag-1與Caspase-3在大腸癌組織中的表達(dá)以及兩者在大腸癌中表達(dá)的相互關(guān)系鮮有相關(guān)的報(bào)道。本研究利用免疫組織化SP 法檢測(cè)人大腸癌組織和正常大腸黏膜組織中Bag-1和Caspase-3的表達(dá)，初步探討兩者與大腸癌臨床病理的關(guān)系以及兩者表達(dá)的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取我院病理科2008年1月～2011年12月手術(shù)切除并經(jīng)病理檢查證實(shí)的大腸癌標(biāo)本66例。另外選取正常大腸黏膜組織15例作為對(duì)照。60例大腸癌患者中，男性38例，女性12例，年齡35～81歲，平均年齡56.3歲，患者術(shù)前均未作放化療等任何抗腫瘤治療。66例中高分化癌21例，中分化癌34例，低分化癌11例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的24例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的42例；Duke's分期:A期23例，B期18例，C期16例，D期9例。

1.2 主要試劑

兔抗人Bag-1多克隆抗體，兔抗人Caspase-3多克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司。生物素化山羊抗兔抗體(二抗)及鏈霉素親生物素-過(guò)氧化物復(fù)合物(SP-9001 HistostainTM-PlusKits)購(gòu)自北京中山生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

Bag-1和Caspase-3免疫組織化學(xué)染色均采用SP法，嚴(yán)格按照SP試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟進(jìn)行。一抗稀釋濃度：Bag-1一抗(1∶100)、Caspase-3一抗(1∶80)，陰性對(duì)照采用磷酸緩沖鹽溶液代替一抗。用已知陽(yáng)性片作為陽(yáng)性對(duì)照，DAB顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核。以細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色或黃色顆粒作為陽(yáng)性反應(yīng)。

1.4 結(jié)果判定

在10×40倍光鏡下隨機(jī)觀察10個(gè)視野,每個(gè)視野計(jì)數(shù)100～200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算出每張切片陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)所占比例。Bag-1染色陽(yáng)性為胞核和胞質(zhì)呈棕黃色，Caspase-3染色陽(yáng)性為細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色，Bag-1、Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞>10%為陽(yáng)性表達(dá)(+)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

兩樣本均數(shù)的比較，應(yīng)用t檢驗(yàn)；多樣本均數(shù)的比較，應(yīng)用ANOVA檢驗(yàn)；兩因素相關(guān)性的分析應(yīng)用spearmen相關(guān)。

2 結(jié)果

2.1 正常大腸黏膜和大腸癌組織中Bag-1和Caspase-3蛋白的表達(dá)情況

Bag-1陽(yáng)性染色呈棕黃色顆粒，染色強(qiáng)弱不等，主要陽(yáng)性表達(dá)在細(xì)胞核，也有少部分表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)， Bag-1在正常大腸組織中陽(yáng)性表達(dá)率為 13.3%(2/15)， 大腸癌組織的陽(yáng)性表達(dá)率為 74.2%(49/66)， 兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

Caspase-3陽(yáng)性表達(dá)主要定位在細(xì)胞胞質(zhì)中，為黃色到棕褐色顆粒。免疫組織化學(xué)檢測(cè)顯示Caspase-3表達(dá)在大腸癌中的陽(yáng)性表達(dá)率為68.2%(45/66)；在正常大腸黏膜中為46.7%(7/15)。Caspase-3在大腸癌組與正常組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。

表1 Bag-1和Caspase-3 在正常大腸黏膜和大腸癌中的表達(dá)情況(例)

2.2 Bag-1和Caspase-3蛋白表達(dá)與大腸癌臨床病理特征的關(guān)系

Bag-1在大腸癌中的高表達(dá)與大腸癌分化程度、Duke's分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，在大腸癌低分化，Duke's C+D期，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的大腸癌中Bag-1蛋白表達(dá)明顯高于中高分化，Duke's A+B期，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的大腸癌組織(P<0.05)。66例大腸癌組織中Caspase-3表達(dá)水平與大腸癌分化程度、Duke's分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床特征均無(wú)關(guān)(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 Bag-1和Caspase-3表達(dá)水平與大腸癌各臨床病理特征的關(guān)系(例)

2.3 Bag-1和Caspase-3在大腸癌中表達(dá)的相關(guān)性

經(jīng)Spearman等級(jí)相關(guān)分析，大腸癌中Bag-1的表達(dá)與Caspase-3呈負(fù)相關(guān)性(γ=-0.417，P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 大腸癌中Bag-1和Caspase-3蛋白表達(dá)的相關(guān)性(例)

3 討論

Bag-1基因位于9p12號(hào)染色體。Bag-1基因編碼的酸性蛋白是1種定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的多功能結(jié)合蛋白，不僅可以通過(guò)其他調(diào)節(jié)因子抑制細(xì)胞凋亡，而且可調(diào)節(jié)細(xì)胞增生、轉(zhuǎn)錄、遷移和移動(dòng)性[5]。Bag-1信號(hào)調(diào)節(jié)通路在腫瘤的進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用，同時(shí)也間接反映了腫瘤細(xì)胞對(duì)治療的反應(yīng)性。Bag-1 在正常組織中弱表達(dá)甚至不表達(dá)，而在多種腫瘤，如肺癌、大腸癌等中均有陽(yáng)性表達(dá)[6，7]，表明，Bag-1表達(dá)與組織細(xì)胞惡變有關(guān)。國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)大腸癌患者Bag-1陽(yáng)性表達(dá)增高與分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，且5年生存率要明顯低于其他患者[8]。本研究結(jié)果顯示，Bag-1 在大腸癌組織中陽(yáng)性表達(dá)明顯高于正常組織。國(guó)內(nèi)學(xué)者采用western-blot和RT-PCR方法聯(lián)合檢測(cè)大腸癌組織，發(fā)現(xiàn)Bag-1表達(dá)明顯高于正常大腸組織[9]。表明Bag-1參與了大腸黏膜由良性向惡性轉(zhuǎn)化的過(guò)程。同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)，Bag-1表達(dá)與腫瘤分化程度、Duke's分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示此蛋白過(guò)度表達(dá)在大腸癌的侵襲過(guò)程中發(fā)揮了一定的作用，這與國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果相一致[10，11]，說(shuō)明 Bag-1的表達(dá)可作為預(yù)測(cè)腫瘤的惡性程度與不良預(yù)后的1個(gè)生物學(xué)指標(biāo)。

Caspase-3 是 Caspase家族成員中細(xì)胞凋亡信號(hào)通路中最重要的最終執(zhí)行因子，當(dāng) caspase- 3 的活性受到抑制而引起細(xì)胞凋亡障礙，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生不可逆性凋亡[12]。本研究結(jié)果表明，Caspase-3在大腸癌中的陽(yáng)性表達(dá)與正常組織之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。有研究發(fā)現(xiàn)在大腸腺瘤性息肉組織中Caspase-3呈低表達(dá)現(xiàn)象，認(rèn)為Caspase-3在大腸癌發(fā)生早期可能起一定作用[13]。Caspase-3表達(dá)與大腸癌患者的分化程度、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Duke's分期等臨床病理特征之間均無(wú)明顯相關(guān)性。提示Caspase-3與大腸癌發(fā)展及預(yù)后無(wú)關(guān)。

本研究顯示，大腸癌中Bag-1和Caspase-3的負(fù)相關(guān)性表達(dá)反映了兩者之間的這種相互抑制的方式。Bag-1僅抑制Caspase-3的激活，并不抑制其合成，Bag-1 作為1種凋亡抑制蛋白在大腸癌中能夠降低 Caspase-3 介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用。Caspase-3 和 Bag-1 可能共同參與大腸黏膜細(xì)胞凋亡過(guò)程的調(diào)節(jié)，同時(shí)也強(qiáng)烈提示在細(xì)胞增殖動(dòng)力學(xué)調(diào)節(jié)中這兩種蛋白之間可能存在著密切聯(lián)系。Caspase-3 基因和Bag-1 基因表達(dá)的關(guān)系對(duì)大腸癌的發(fā)生、發(fā)展起著重要作用。

[1] 顧 晉.下消化道腫瘤學(xué)〔M〕.北京： 北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社，2004：2～7.

[2] Takayama S,Sato T,Krajewski S,et al.Cloning and functi-onal analysis of BAG-1：a novel bcl-2-binding protein with anti-cell death activity〔J〕.Cell,1995,80(2)：279.

[3] Townsend PA,Cutress RI,Sharp A,et al.BAG-1:a mltifunctional regulator of cell growth and survival〔J〕.Biochim Biophys Acta,2003,1603(1)：83.

[4] Mitsiades J.Total and high-molecular weight adi-ponectin in breast cancer：in vitro and in vivo studies〔J〕.J Clin Endocrinol Metab,2007,92:1041.

[5] Sharp A，Cutress RI，Johnson PW，et al.Short peptides derived from the BAG-1 C-terminus inhibit the interaction between BAG-1 and HSC70 and decrease breast cancer cell growth〔J〕.FEBS Lett，2009,583(21):3405.

[6] 黃 凱， 崔廣暉 ，趙 松，等.非小細(xì)胞肺癌組織 BAG-1 和 Caspase-3 基因的表達(dá)及其關(guān)系〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2012,32(4)：696.

[7] 孫念峰，王國(guó)斌，陳景波.結(jié)腸癌組織中抗凋亡基因bag-1和bcl-2的表達(dá)及意義〔J〕.腫瘤防治研究,2006,33(3)：180.

[8] Kikuchi R,Noguchi T,Takeno S,et al.Nuclear Bag-1 expression reflects malignant potential in colorectal carcinomas〔J〕.Br J Cancer,2002,87(7):1136.

[9] 楊光華,趙 晶,李 磊，等.BAG-1在大腸癌中的表達(dá)及其臨床意義〔J〕.腫瘤防治研究，2012,39(1):71.

[10] 孫念峰，張建良，王國(guó)斌.抗凋亡基因 Bag-1 和 Bcl-2 在結(jié)腸癌組織的表達(dá)及相互關(guān)系的研究〔J〕.中國(guó)現(xiàn)代普通外科進(jìn)展，2008,11(5)：395.

[11] Kikuchi R,Noguchi T,Takeno S,et al.Immunohistochemical detection of menbrance-type-1-matrix metalloproteinase in colorectal carcinoma〔J〕.Br J Cancer,2000,83(11):215.

[12] Song Y,Kong BH,Ma DX,et al.Procaspase-3 echance the in vitro effect of cytosine deaminase-thymidine kinase disuicide gene therapy on human ovarian cancer 〔J〕.Zhonghua Fu Chan Ke Za Zhi,2005,40 (6):411.

[13] 王文娟,高玉彤.PUMA、COX-2、Caspase-3在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及臨床意義〔J〕.山東醫(yī)藥，2011,51(11)：15.