凝溶膠蛋白在胃癌組織中的表達(dá)及臨床意義

李俊華 袁向亮 沈立松

胃癌是我國常見的惡性腫瘤，也是致死率最高的惡性腫瘤之一。關(guān)于胃癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制目前仍不明確。GSN是胞質(zhì)內(nèi)重要的actin調(diào)節(jié)蛋白。GSN廣泛表達(dá)于正常組織中[1]，在機(jī)體生命活動中發(fā)揮重要作用，已有研究顯示，GSN具有明顯地腫瘤抑制作用，在多種腫瘤中其表達(dá)水平明顯降低，與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，被認(rèn)為是1種候選的抑癌基因[2]。本研究應(yīng)用免疫組化蛋白印跡法，檢測GSN在胃癌組織及其癌旁組織中的表達(dá)情況，并探討其表達(dá)與胃癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系及其意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集2008年1月至2010年12月本院收治的、28例胃癌患者手術(shù)切除的胃癌組織標(biāo)本。男性17例，女性11例，平均年齡64.6歲。組織學(xué)分級：高分化10例，中分化8例，低分化和未分化10例；TNM分期：Ⅰ期8例，Ⅱ期7例，Ⅲ期6例，Ⅳ期7例。另收集2011年1月至2012年1月本院手術(shù)切除的新鮮胃癌組織及相應(yīng)的癌旁組織各12例，其中男性6例，女性6例，平均年齡60歲。患者術(shù)前未行放、化療及免疫治療。

1.2 試劑和儀器

鼠抗人GSN單克隆抗體(美國Sigma公司)；封閉液(Horse serum)；二抗(anti-mouse IgG)和ABC液均采用VECTASTAIN ABC KIT(美國Vector Laboratories公司)中的試劑。組織蛋白提取液為T-PER Tissue protien Extraction Reagent(美國Thermo公司)；二抗為Goat anti-Mouse IRDY 800CW(美國LI-COR Biosciences公司)；Odyssey掃膜儀(美國LI-COR Biosciences公司)。

1.3 免疫組化

常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，免疫組化ABC法染色。常規(guī)脫蠟脫水后用檸檬酸鈉(pH 6.0)作為抗原修復(fù)液，120℃高壓修復(fù)3 min，3%過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化酶，封閉30 min，一抗4℃過夜，一抗為鼠抗人GSN單克隆抗體，工作濃度為1∶1000，用PBS取代一抗作為陰性對照，以已知陽性切片作為陽性對照。二抗、封閉液和ABC液均采用VECTASTAIN ABC KIT中的試劑。DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹脂封片。

1.4 蛋白印跡

新鮮組織手術(shù)切除后半小時內(nèi)放置液氮內(nèi)速凍，然后于-80℃保存，標(biāo)本收齊后集中提取蛋白。200 mg組織中加入1000 μl蛋白提取液和10 μl蛋白酶抑制劑，剪碎后勻漿，高速離心后取上清加上樣緩沖液煮沸冷卻后上樣電泳。常規(guī)電泳，用PDVF膜轉(zhuǎn)膜，Odyssey封閉液封閉1 h，一抗4℃過夜，一抗為鼠抗人GSN單克隆抗體，工作濃度為1∶1000；二抗為羊抗鼠熒光二抗，工作濃度為1∶5000，二抗室溫孵育1 h，洗膜后，用Odyssey掃膜儀掃膜。

1.5 免疫組化結(jié)果判定及分級標(biāo)準(zhǔn)

免疫組化結(jié)果采用雙盲法。以已知陽性片作為陽性對照，每組均用PBS代替一抗作為陰性對照。根據(jù)陽性細(xì)胞百分比及染色強(qiáng)度進(jìn)行綜合評分，陽性細(xì)胞百分比為5個高倍鏡(10 × 40)隨機(jī)視野下陽性細(xì)胞百分比。按染色強(qiáng)度評分：無色為0分、淺黃色為1分、棕黃色為2分，棕褐色為3分。按陽性細(xì)胞百分比評分：0分為無陽性細(xì)胞，陽性細(xì)胞百分比≤10%為1分， 11%～50%為2分， 51%～80%為3分，﹥80%為4分。最后按以上兩項評分的乘積進(jìn)行綜合評分。每張切片由兩名高年資病理科醫(yī)生分別計數(shù)評分。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 GSN在胃癌組織中的表達(dá)情況

GSN表達(dá)水平在正常胃腺上皮細(xì)胞、部分異形性增生胃腺上皮細(xì)胞及胃癌腫瘤細(xì)胞中，呈逐漸下降趨勢。GSN在正常胃腺上皮細(xì)胞中呈高表達(dá)，胞質(zhì)呈棕黃色，胞核染成棕褐色；在胃癌腫瘤細(xì)胞中GSN普遍呈低表達(dá)，胞質(zhì)染成淡黃色，胞核基本未著色。部分異形性增生腺上皮細(xì)胞，胞質(zhì)染成淡黃色，胞核染成棕黃色，部分細(xì)胞胞核未著色。

2.2 不同臨床分期胃癌組織中GSN表達(dá)情況

Ⅰ期胃癌組織中可見部分腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)和胞核均被染成棕黃色，陽性細(xì)胞百分率為34.7%，GSN表達(dá)得分為2.75±0.91。Ⅱ期胃癌組織中GSN表達(dá)明顯減弱，部分腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)染成淺黃色，大多數(shù)腫瘤細(xì)胞胞核無明顯染色，GSN陽性細(xì)胞百分率為26.3%，GSN表達(dá)得分為2.23±0.95。Ⅲ期胃癌組織中只有少數(shù)腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)陽性染色，陽性細(xì)胞百分率為5.3%，GSN表達(dá)得分為1.07±1.10。Ⅳ期胃癌組織中GSN幾乎無表達(dá)，陽性細(xì)胞百分率僅為2.2%，GSN得分為0.74±0.61。可見，GSN表達(dá)隨著胃癌臨床分期的增加而逐漸減弱，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 GSN在TNM不同分期胃癌中的表達(dá)情況

2.3 GSN表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系(表1)

GSN表達(dá)與胃癌患者年齡、性別無關(guān)(P>0.05)，與腫瘤細(xì)胞的分化程度、浸潤程度和淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移有一定相關(guān)性，其中中低分化胃癌組織GSN表達(dá)水平明顯低于高分化胃癌患者，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(圖2a)。腫瘤浸潤至漿膜層及其以外的病例GSN表達(dá)水平明顯低于腫瘤局限于漿膜層內(nèi)的病例，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(圖2b)。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者GSN的表達(dá)強(qiáng)度明顯弱于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(圖2c)。

表1 GSN表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系

圖2 GSN表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系

2.4 GSN在胃癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況

由圖3可見，胃癌組織中GSN表達(dá)水平明顯低于相應(yīng)的癌旁組織；本組12例胃癌組織中10例患者GSN表達(dá)量明顯低于相應(yīng)的癌旁組織，GSN低表達(dá)率為83.3%(10/12)。

圖3 GSN在胃癌組織及相應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)情況

3 討論

GSN是胞質(zhì)內(nèi)重要的actin調(diào)節(jié)蛋白，可調(diào)節(jié)肌動蛋白的重組，參與多種與細(xì)胞骨架排列相關(guān)的細(xì)胞進(jìn)程。更多研究表明，GSN在細(xì)胞信號傳導(dǎo)中作為轉(zhuǎn)錄輔助因子對細(xì)胞周期、凋亡起調(diào)控作用[3]。GSN與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，被認(rèn)為是1種候選的抑癌基因[2]。本研究發(fā)現(xiàn)GSN在胃癌細(xì)胞及腫瘤組織中的表達(dá)明顯降低，并隨著腫瘤進(jìn)展及分化程度降低而降低，GSN在胃癌發(fā)生發(fā)展中可能起著抑制作用。

許多研究發(fā)現(xiàn)GSN在多種腫瘤中表達(dá)明顯降低。在人膀胱癌中，GSN在6個膀胱癌細(xì)胞系和77.8%(14/18)的膀胱癌組織中表達(dá)缺失和明顯降低[4]。在乳腺癌中，GSN的蛋白和mRNA的表達(dá)水平在乳腺癌細(xì)胞系中缺失或明顯低于正常人乳腺上皮細(xì)胞和良性永生化細(xì)胞。免疫組織化學(xué)顯示，GSN在70%的浸潤性乳腺癌[5]、55%(48/68)的非小細(xì)胞肺癌[6]、68.1%(15/22)的胃癌[7]和62.7%(32/51)的口腔鱗癌組織[8]中表達(dá)明顯降低。本實(shí)驗(yàn)中，采用免疫組化方法，我們發(fā)現(xiàn)在胃癌腫瘤組織切片中GSN在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)也明顯低于正常腺上皮細(xì)胞。我們還通過蛋白印跡法檢測到在新鮮的胃癌組織中GSN的表達(dá)明顯低于與之對應(yīng)的癌旁組織。但是GSN在腫瘤細(xì)胞中低表達(dá)的機(jī)制目前并不是很清楚。有研究表明，在人乳腺癌和非小細(xì)胞肺癌中，調(diào)控GSN的基因序列并沒有發(fā)生突變、重組和缺失[5,6]。有關(guān)胃癌的研究中，研究者認(rèn)為，在胃癌組織中組蛋白去乙酰化酶1的高表達(dá)與GSN的低表達(dá)密切相關(guān)，而組蛋白乙酰-去乙酰之間的轉(zhuǎn)換對調(diào)控細(xì)胞周期、凋亡、分化有重要作用[7]。說明GSN在腫瘤中的低表達(dá)是由于基因外的機(jī)制調(diào)控的。另外有關(guān)胰腺癌的研究表明，泛素-蛋白酶體途徑參與了GSN的降解，使得GSN在胰腺癌中呈低表達(dá)[9]。說明蛋白翻譯后修飾也是GSN在腫瘤中低表達(dá)的一個重要因素。

有學(xué)者對GSN在腫瘤中表達(dá)明顯降低的現(xiàn)象進(jìn)行了深入的研究，發(fā)現(xiàn)將外源GSN cDNA全長轉(zhuǎn)入膀胱癌細(xì)胞系過表達(dá)后，可抑制腫瘤細(xì)胞生長，降低腫瘤細(xì)胞的集落形成能力和裸鼠致瘤性。重組腺病毒編碼的野生型GSN(Ad-GSN)轉(zhuǎn)入膀胱癌細(xì)胞系后可以使細(xì)胞停滯于G/M期，原位膀胱癌動物模型經(jīng)Ad-GSN治療后，腫瘤體積縮小了90%[10]，這些實(shí)驗(yàn)證據(jù)提示GSN具有明顯地腫瘤抑制作用。許多研究證實(shí)，GSN低表達(dá)與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后等有關(guān)。有研究表明，GSN低表達(dá)與卵巢癌分化程度密切相關(guān)，在分化程度較高的腫瘤細(xì)胞中GSN表達(dá)水平明顯高于未分化的腫瘤細(xì)胞[11]。在本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)，GSN表達(dá)與胃癌TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和浸潤程度有關(guān)。晚期胃癌中GSN表達(dá)強(qiáng)度明顯低于早期胃癌。中低分化和未分化的腫瘤細(xì)胞中GSN的表達(dá)水平明顯低于高分化腫瘤細(xì)胞。腫瘤浸潤到漿膜層及漿膜層之外的胃癌患者GSN表達(dá)水平明顯低于局限于漿膜層之內(nèi)的患者。說明GSN在胃癌腫瘤細(xì)胞發(fā)生發(fā)展中起著一定的調(diào)控作用，隨著腫瘤的發(fā)展，GSN表達(dá)明顯下降，失去了調(diào)控細(xì)胞周期、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的作用，使得腫瘤細(xì)胞生長失控，從而促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。與之相反的是在膀胱移形細(xì)胞癌中，隨著腫瘤分級和分期的增加，GSN表達(dá)逐漸增強(qiáng)，并且在腫瘤后期GSN表達(dá)的逐漸增強(qiáng)與腫瘤預(yù)后密切相關(guān)，研究者認(rèn)為這與GSN可以增強(qiáng)細(xì)胞運(yùn)動有關(guān)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[12]。而在本實(shí)驗(yàn)中，我們還發(fā)現(xiàn)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例中GSN表達(dá)水平明顯低與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例，表明GSN在腫瘤轉(zhuǎn)移中可能起抑制作用，GSN表達(dá)的降低失去了對actin微絲細(xì)胞骨架的調(diào)控作用，使細(xì)胞的運(yùn)動性、形狀、生長以及凋亡發(fā)生了改變。這與Tanaka等[13]的研究一致，通過小RNA干擾乳房上皮細(xì)胞中GSN的表達(dá)后，乳房上皮細(xì)胞發(fā)生了明顯的變化，成纖維細(xì)胞發(fā)生了類型轉(zhuǎn)化，接觸抑制現(xiàn)象消失，細(xì)胞成單層灶狀生長，侵襲性和運(yùn)動能力增強(qiáng)[11]，說明對腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移GSN起著抑制作用。

綜上，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了GSN在胃癌組織中表達(dá)缺失或明顯降低，并且GSN表達(dá)與腫瘤分化、浸潤及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，這可能是胃癌發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制之一。GSN作為一個候選的抑癌癌基因，在多種腫瘤中普遍呈低表達(dá)，可是GSN低表達(dá)的機(jī)制和其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用并不是很明確。另外GSN還是1種分泌型蛋白存在于血清中，因此檢測血清中GSN的表達(dá)水平可能成為一個有價值的腫瘤診斷標(biāo)志物[14]。GSN在胃癌中表達(dá)情況的研究國內(nèi)暫無相關(guān)報道，國外的相關(guān)報道也較少，我們的研究或許對胃癌機(jī)制的研究提供了新的思路。

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