金黃色葡萄球菌rep-PCR指紋圖譜分型技術反應條件的優化

林 琳，王 晶

(大連醫科大學 附屬第一醫院 檢驗科， 遼寧 大連 116011)

金黃色葡萄球菌分型方法可分為表型分型和基因分型，隨著分子生物學理論和實驗技術的不斷完善，基因分型技術在判斷院內感染爆發流行，了解菌株間的相關性，確定傳染源與流行趨勢方面具有重要的意義并被廣泛使用[1]。rep-PCR即重復序列引物聚合酶鏈反應技術是根據基因組中的重復序列設計引物，擴增重復序列間的片段，通過電泳產生的特異性指紋圖譜鑒別細菌基因組間的差異[2]。主要的重復片段主要分為基因外回文序列(rep)和腸桿菌科基因間重復序列(ERIC)兩種。這種新方法相對于“金標準”的脈沖場電泳，操作簡單易行，在實驗室可廣泛應用。但其結果的重復性和指紋圖譜的清晰程度與實驗條件密切相關。本研究針對兩種不同的實驗引物，以及引物濃度和退火溫度進行優化，以期得到最佳的指紋圖譜。

1 材料和方法

1.1 材 料

金黃色葡萄球菌標準菌株ATCC25923(本室保藏)；細菌基因組提取試劑盒、溶菌酶(北京天根生化科技有限公司)；Taq 酶、maker及PCR相關試劑(大連寶生物工程有限公司)；相關rep-PCR引物序列(引物rep：TCGCTCAAAACAACGACACC/引物ERIC-Ⅱ:AAGTAAGTGAGTGGGGTGAGCG)(均合成于大連寶生物工程有限公司)。

1.2 細菌基因組DNA的提取

接種菌株于LB培養基中，35 ℃搖床培養18～24 h，收集菌株于EP管中，加入100 U/mL溶菌酶 20 μL，37 ℃孵育破壁30 min以上，按照基因組DNA提取試劑盒操作說明書提取，最后用100 mL TE buffer 洗脫，-20 ℃低溫保存。

1.3 rep-PCR擴增引物的篩選

根據參考文獻[3-4],引物ERIC-Ⅱ及引物rep均可以用于rep-PCR的擴增，其反應體系均為：總反應體系25 μL，DNA模板5 μL，10×PCR buffer 2.5 μL, 25 mmol/L Mg2+2.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 2 μL, 5 U/μL Taq酶 0.3 μL，100 pmol/μL引物ERIC-Ⅱ 0.2 μL，100 pmol/μL引物REP 0.25 μL，雙蒸水補足。

設定循環參數為95 ℃預變性3 min，94 ℃ 60 s，50 ℃ 60 s，72 ℃ 120 s，共35個循環；72 ℃延伸5 min。濃度為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統成像。

1.4 rep-PCR反應體系的優化

以引物rep作為實驗引物，在不同的引物濃度(0.8、1.0、1.2 pmol/μL)下進行PCR檢測，其他條件一致，在不同的退火溫度下(35、40、45、50、55 ℃)進行PCR檢測，其他條件一致。PCR擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統成像。

2 結 果

2.1 rep-PCR 引物的篩選

分別用引物ERIC-Ⅱ及引物rep對標準菌株ATCC25923進行擴增，可見引物rep擴增出的條帶數量和亮度均好于引物ERIC-Ⅱ，所以本實驗選用引物rep作為擴增金黃色葡萄球菌的引物，見圖1。

圖1 不同的引物進行rep-PCR擴增Fig 1 The rep-PCR products at different primer

2.2 rep-PCR反應體系的優化

2.2.1 引物濃度的優化：當引物濃度分別為0.8 pmol/μL，1.0 pmol/μL，1.2 pmol/μL時，均可擴增出較多的條帶，其中以濃度為1.0 pmol/μL時的條帶數量最多，亮度最強，終選擇引物濃度1.0 pmol/μL為最終的引物濃度。見圖2。

圖2 rep-PCR引物濃度的優化Fig 2 The rep-PCR products at different primer concentration

2.2.2 退火溫度的優化：當退火溫度為35、40、45、50、55 ℃時，以退火溫度為45 ℃時條帶數量最多，亮度最強，終選擇以45 ℃為最終的退火溫度。見圖3。

3 討 論

有關基因分型的方法有很多種，包括染色體DNA限制性內切酶的分析、PFGE、REPD、rep-PCR等，每種方法都有其各自的優缺點。rep-PCR即重復序列引物聚合酶鏈反應技術，是以基因組的一段重復回文序列為引物，對細菌基因組的DNA進行PCR擴增，根據得到的指紋圖譜可對細菌進行同源性分析[5]。rep-PCR兩種主要重復序列片段是基因外回文序列(rep)和腸桿菌科基因間重復序列(ERIC)，這兩種引物分別來自肺炎支原體和大腸桿菌的重復序列片段。用引物rep和引物ERIC-Ⅱ分別對金黃色葡萄球菌ATCC25923進行擴增，均可擴增出指紋圖譜，只是數量和亮度上有所差異，應用引物rep擴增出的條帶數量和亮度上都好于引物ERIC-Ⅱ，可見引物rep和引物ERIC-Ⅱ均可以用于金黃色葡萄球菌的同源性分析，由于rep-PCR擴增理想的指紋圖譜亮度越高越好,且數量在6～8條之間，故認為對于金黃色葡萄球菌進行rep-PCR指紋圖譜分析，基因外回文序列(rep)優于腸桿菌間重復序列(ERIC)。

圖3 rep-PCR退火溫度的優化Fig 3 The rep-PCR products at different annealing temperature1～5：退火溫度分別為35、40、45、50、55 ℃, M:Marker

rep-PCR具有分辨率好，操作簡單易行等優點，但也有其局限性，其中主要的原因是結果的重復性與實驗條件密切相關，反應條件不同，所得到的指紋圖譜不同。所以本研究以ATCC25923為模板，對引物濃度以及退火溫度進行優化，希望得到最佳的擴增條件。首先，在其他反應條件固定的條件下，引物濃度設為3個梯度進行擴增，分別為0.8、1.0、1.2 pmol/μL，當引物濃度為1.0 pmol/μL時，擴增出的效果最佳；另外退火溫度的高低對擴增的結果也有較大的影響，在理想狀態下，退火溫度足夠低，可以保證引物的目的序列有效退火，同時還要足夠高，以減少非特異擴增[6]，故本研究在其他反應條件固定的情況下，將退火溫度設為35、40、45、50、55 ℃ 5個梯度，當退火溫度為45 ℃時，擴增的條帶數和亮度均好于其他，高于相關文獻報道[7]。綜上所述，本研究為金黃色葡萄球菌的rep-PCR分型找出了最佳的反應條件，為金黃色葡萄球菌的同源性分析提供了依據。

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