電針次髎穴對慢性膀胱過度活動癥模型大鼠尿動力學及脊髓背角SP和CGRP影響

孫衛(wèi)兵，楊 帆，齊清會

(1.大連醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院泌尿外科，遼寧大連 116027;2.大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院普外科，遼寧大連 116011)

電針次髎穴對慢性膀胱過度活動癥模型大鼠尿動力學及脊髓背角SP和CGRP影響

孫衛(wèi)兵1，楊 帆1，齊清會2

(1.大連醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院泌尿外科，遼寧大連 116027;2.大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院普外科，遼寧大連 116011)

［目的］探討電針次髎穴對環(huán)磷酰胺(cyclophsphamide，CYP)致慢性膀胱過度活動癥(overactive bladder，OAB)模型大鼠尿動力學及脊髓背角p物質(substance P，SP)和降鈣素基因相關肽(calcitonin-gene related peptide，CGRP)的影響。［方法］雌性大鼠25只隨機分為對照組5只，OAB模型組10只，OAB+電針(電針組)10只。其中模型組和電針組動物腹腔內注射環(huán)磷酰胺誘導OAB，應用膀胱測壓技術動態(tài)觀察電針次髎穴后排尿間期、基礎膀胱壓、膀胱最大充盈壓及最大排尿壓的變化;應用免疫組織化學方法定量觀察電針后脊髓背角SP和CGRP表達變化。［結果］電針組和模型組的排尿間期與對照組相比明顯縮短(P＜0.05)，基礎膀胱壓明顯升高(P＜0.01)。電針后電針組的基礎膀胱壓較模型組明顯降低(P＜0.01)，排尿間期較模型組明顯延長(P＜0.01)。與對照組相比，模型組脊髓后角SP及CGRP表達明顯升高(P＜0.05);與模型組相比，電針組的脊髓后角SP及CGRP表達降低(P＜0.05)。［結論］電針次髎穴能抑制環(huán)磷酰胺誘導的大鼠膀胱過度活動，降低脊髓后角SP和CGRP的表達，電針次髎穴治療OAB可能與抑制膀胱傳入神經(jīng)的興奮性及傳入遞質的釋放與合成有關。

電針;膀胱過度活動癥;P物質;降鈣素基因相關肽;尿動力學

正常的膀胱感覺功能是維持人體周期性儲尿和排尿的重要前提之一。近年研究表明，膀胱感覺功能異常在多種下尿路癥狀(low urinary tract symptoms，LUTS)的發(fā)生中起重要作用［1］。感覺增強會導致尿頻、尿急、尿痛和急迫性尿失禁等儲尿期癥狀，引起逼尿肌過度活動(detrusor overactivity，DO)，也是膀胱過度活動癥(overactive bladder，OAB)主要發(fā)病機制之一。而傳入性C纖維活動過度是逼尿肌反射亢進的關鍵病理機制［2］。

電針治療OAB在臨床上已被認可，本實驗采用腹腔內注射環(huán)磷酰胺(CYP)誘導膀胱感覺異常的膀胱過度活動癥大鼠模型，通過檢測電針次髎穴前后大鼠尿動力學，L6脊髓背角P物質(substance P，SP)和降鈣素基因相關肽(calcitonin-gene related peptide，CGRP)表達的變化探討電針對膀胱儲尿功能的影響及可能的作用機制。

1 材料和方法

1.1 動物及分組

健康、雌性、無孕史 SD大鼠25只，體重約在180～220 g，由大連醫(yī)科大學動物實驗中心提供，許可證號:SCXK(遼)2008-0002。將大鼠隨機分成對照組(5只)，模型組(10只)和電針組(10只)，實驗過程中對動物的處置符合國家頒布的有關善待實驗動物的指導性意見要求。兔抗CGRP多克隆抗體(AB8056，abcam)兔抗 SP多克隆抗體(AB1566，CHEMICON INTERNATIONAL)。

1.2 膀胱過度活動模型的建立［6］

模型組及電針組小鼠腹腔內環(huán)磷酰胺誘導，建立膀胱過度活動模型。環(huán)磷酰胺的劑量為75 mg/kg，1次/3 d，共兩周。對照組用相同容量的生理鹽水注射，注射時間與模型組相同。

1.3 電針治療方法

按照比較解剖和骨度分寸法為依據(jù)進行穴位定位。大鼠次髎穴(骶3孔)的定位:脊髓骶椎2、3節(jié)段旁開約0.5 cm處，不銹鋼毫針以直插所選部位，進針約30～40 mm，接電針儀。刺激頻率為20 Hz，連續(xù)波，針刺時間60 min。

1.4 尿動力學檢查方法及檢查指標

大鼠腹腔注射烏拉坦(1.0 g/kg)麻醉，大鼠尿道內插入F3導管，接三通管，其中一端接尿動力儀的膀胱壓力傳感器，體內置零;另一端接微量泵，以0.2 mL/min的速度向膀胱內灌注室溫下生理鹽水，至大鼠開始排尿時停止注水，連續(xù)測定3個排尿周期，測定排尿間隔時間、基礎膀胱壓、膀胱最大充盈壓、最大排尿壓。

1.5 分組檢測

模型組:CYP誘導膀胱過度模型后行第1次尿動力學檢測，連續(xù)測定3個排尿周期，1 h后重復進行第2次尿動力學檢測。

電針組:CYP誘導膀胱過度模型后行第1次尿動力學檢測，連續(xù)測定3個排尿周期，電針60 min后行第2次尿動力學檢查。

對照組:尿動力學檢測同模型組。

1.6 組織取材處理、觀察指標及方法

組織取材:大鼠腹腔注射烏拉坦(1.0 g/kg)維持麻醉，迅速打開胸腔，立即左心室-主動脈插管，右心耳切開，20℃的生理鹽水100 mL快速灌注沖洗后，再灌注室溫的4%多聚甲醛(0.1 mol/L PBS配制)400～500 mL約1 h，取L6-S1段的脊髓(長約1 cm)，置于4℃、4%多聚甲醛中外固定20 h，轉入4℃、30%蔗糖溶液(0.1 mol/L PBS配制)過夜，待標本檢測。

免疫組織化學程序:(1)冰凍切片，標本冰凍切片，厚度為20 μm，并且以每20取4片的方法取片;(2)脊髓后角切片采用免疫組化 ABC法行 SP、CGRP染色，依次加入一抗、二抗孵育，顯色劑染色及復染、封片。

計算機圖像分析:Imageproplus圖像分析系統(tǒng)進行分析，每張切片觀察3個視野，計算平均吸光度值。

1.7 統(tǒng)計學方法

計量資料表示為均數(shù)±標準差(±s)，采用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計分析，組內比較采用配對t檢驗，組間比較Oneway ANOVA方差分析，運用GLM過程，P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 治療前后尿動力學參數(shù)變化

治療前電針組和模型組的排尿間期與對照組相比明顯縮短(P＜0.05)，基礎膀胱壓明顯升高(P＜0.01)。治療后電針組基礎膀胱壓較模型組明顯降低(P＜0.01)，排尿間期較模型組明顯延長(P＜0.01)，見表1。

表1 治療前后尿動力學參數(shù)比較Tab 1 Compare urodynamic parameter before and after treatment (±s)

表1 治療前后尿動力學參數(shù)比較Tab 1 Compare urodynamic parameter before and after treatment (±s)

1)與對照組相比，P ＜0.05;2)與對照組相比，P ＜0.01;3)與模型組相比，P ＜0.01

模型組(n=10) 電針組(n=10) 對照組(n=5)排尿間期(min)第 1 次 9.1 ±1.11) 9.7 ±1.51) 13.9 ±1.3第 2 次 10.2 ±1.6 13.2 ±1.13) 14.2 ±1.2基礎膀胱壓(cm H2O)第 1 次 15.2 ±2.22) 13.1 ±2.12) 8.9 ±1.4第 2 次 14.6 ±1.3 10.8 ±1.43) 9.4 ±1.3最大膀胱充盈壓(cm H2O)第 1 次 23.4 ±3.3 22.3 ±2.6 18.3 ±1.7第 2 次 21.8 ±3.4 24.8 ±3.2 17.9 ±1.4最大排尿壓(cm H2O)第 1 次 49.2 ±3.7 39.4 ±3.1 40.7 ±3.3第2次47.3 ±3.2 36.5 ±3.7 42.3 ±3.4

2.2 骶髓排尿中樞SP及CGRP表達變化

模型組骶髓排尿中樞SP及CGRP表達較對照組明顯升高(P＜0.05);電針組的骶髓排尿中樞SP及CGRP表達比模型組降低(P＜0.05)，電針可以降低逼尿肌反射亢進大鼠骶髓排尿中樞 SP及CGRP 的表達，見表2，圖 1、2。

表2 脊髓后角I、II層中SP、CGRP陽性纖維和終末平均光密度(A值)Tab 2 Mean optical density of SP，CGRP positive fibers in laminaeⅠ，Ⅱ in dorsal horn of sacral cord (±s)

表2 脊髓后角I、II層中SP、CGRP陽性纖維和終末平均光密度(A值)Tab 2 Mean optical density of SP，CGRP positive fibers in laminaeⅠ，Ⅱ in dorsal horn of sacral cord (±s)

1)與對照組相比，P ＜0.05;2)與模型組相比，P ＜0.05

SP CGRP模型組 1.16 ±0.191) 1.28 ±0.161)電針組 0.86 ±0.122) 0.92 ±0.092)對照組0.76 ±0.11 0.85 ±0.10

圖1 大鼠脊髓背角P物質表達的影響Fig 1 Influence of electroacupuncture on expression of substance P in the dorsal horn of spinal cord

圖2 大鼠脊髓背角CGRP表達的影響Fig 2 Influence of electroacupuncture on expression of CGRP in the dorsal horn of spinal cord

3 討 論

DO是引起膀胱過度活動癥的主要原因，目前對OAB的基礎研究幾乎完全以DO為基礎來進行，且主要集中在逼尿肌方面的研究。抗膽堿藥物治療臨床上未能取得滿意的療效，說明阻斷傳出神經(jīng)抑制逼尿肌過度活動并不是解決OAB癥狀的唯一途徑，因此目前許多學者開始研究膀胱傳入神經(jīng)的作用。

電針次髎穴治療OAB臨床上已取得較滿意的療效。次髎穴位于第2骶后孔，骶神經(jīng)都從骶后孔通過，對次髎穴進行針刺加電刺激干預和骶神經(jīng)調節(jié)有相似的作用。針刺治療逼尿肌過度活動的作用機制目前尚不十分明確。動物實驗顯示:針刺通過抑制儲尿期副交感排尿中樞的興奮性，從而降低逼尿肌的緊張性收縮;也有學者研究證實:針刺能抑制膀胱傳入神經(jīng)的興奮性來抑制逼尿肌過度活動［3-4］。然而這些逼尿肌活動亢進的動物模型中多為L-多巴誘發(fā)的模型，脊髓橫斷模型等。但上述模型均不是由膀胱病變引起傳入神經(jīng)功能異常有關的動物模型，不能直接證明電針具有降低傳入神經(jīng)興奮性的作用。

動物實驗中應用不同的化學浸潤性物質可導致膀胱的過度活動，環(huán)磷酰胺是最常用的一種。腹腔內注射環(huán)磷酰胺可誘導大鼠膀胱產生出血性膀胱炎，通過C纖維引起膀胱的疼痛和刺激使排尿頻率的增加，排尿膀胱容量的減少，最大排尿壓力的減少以及膀胱基礎壓的增加，是與膀胱感覺異常有關的逼尿肌活動亢進的理想動物模型［5］。電針對這類動物模型排尿功能的影響尚未見文獻報道。

本實驗結果顯示:與對照組相比，環(huán)磷酰胺誘導的膀胱過度活動癥大鼠排尿頻率增加，膀胱基礎壓明顯增高。電針“次髎穴”60 min后排尿頻率顯著減少，膀胱壓明顯下降。電針次髎穴對環(huán)磷酰胺致大鼠逼尿肌活動亢進有明顯的抑制作用。

近年來C類傳入纖維作用在OAB的作用越來越受到關注。腹腔內注射環(huán)磷酰胺可誘導大鼠膀胱產生出血性膀胱炎，通過C纖維引起膀胱逼尿肌的過度活動。正常膀胱存在的感覺纖維主要分為Aδ類和C類，Aδ類為有髓鞘快傳輸纖維而C類傳入纖維為無髓鞘的慢傳輸型神經(jīng)纖維。膀胱的傳入神經(jīng)(健康脊髓)的興奮主要由Aδ類纖維介導，Aδ纖維通過脊髓將信息傳到腦干，然后傳遞至中腦水管周圍的灰質，最后將膀胱充盈情況傳遞到腦橋排尿中樞Aδ纖維對膀胱的被動收縮和主動收縮都敏感。C類纖維其數(shù)量占膀胱傳入纖維的60.0% ～70.0%，生理情況下只在膀胱高度充盈時C纖維才被激活。然而，這些纖維可被膀胱粘膜的化學性刺激或者冷刺激激活。在化學性刺激作用下，C纖維表現(xiàn)為膀胱空虛時自發(fā)放電，膀胱充盈時放電增強［7］。膀胱內注射辣椒素使C纖維脫敏，膀胱過度活動可被抑制，但是并沒有抑制正常大鼠的排尿反射，這表明C纖維傳入通路對正常排尿反射是非必須的［8］。有學者研究表明:電針骶部穴位能降低髓髓排尿中樞c-fos的表達，表明C纖維活動受到抑制，推測這可能是電針治療逼尿肌反射亢進的機制之一［4］。

在脊髓中CGRP主要存在于小C纖維，Aδ類纖維的初級傳入神經(jīng)中，而外周傷害性刺激信息主要是由小C纖維，Aδ類纖維傳遞。大部分CGRP免疫反應陽性物神經(jīng)分布于脊髓表層的兩個脊髓背角。該部位也含有豐富的SP，其中一部分來源于脊髓背根感覺神經(jīng)節(jié)的無髓C纖維，是傷害性初級傳入末梢釋放的一種興奮性神經(jīng)遞質，存在于脊髓RexedⅠ層和II層的Aδ和C纖維上。外周性傷害刺激這些傳熱纖維可通過背角板層Ⅰ和Ⅱ的中間神經(jīng)元相互作用，將神經(jīng)肽遞質SP背根神經(jīng)節(jié)傳送至脊髓背角，引起脊髓背角SP的釋放。脊神經(jīng)節(jié)細胞內合成后運輸?shù)礁杏X神經(jīng)末梢，并在化學性刺激下或疼痛感覺時釋放。CGRP與P物質(SP)共存于DRG的初級傳入神經(jīng)元中。CGRP可以抑制與SP降解有關的SP內肽酶，使SP的作用增加或延長。

目前有實驗證實環(huán)磷酰胺誘導的膀胱炎膀胱傳導通路中CGRP或SP表達上調。支配膀胱及尿道的背神經(jīng)根神經(jīng)節(jié)細胞體或突起中含有大量的神經(jīng)肽類，PS和CGRP廣泛分布在這些細胞中。環(huán)磷酰胺誘導慢性膀胱炎模型中CGRP和SP-IR在與排尿反射有關的脊髓節(jié)段和背神經(jīng)根神經(jīng)節(jié)(L6，S1)中增高。椎管內注射SP拮抗劑能減少膀胱逼尿肌過度活動，能增加清醒狀態(tài)下大鼠的膀胱容量，排尿壓無明顯改變。CGRP和SP-IR膀胱傳入神經(jīng)細胞中樞和外周投射系統(tǒng)表達增加有助于這種過度活動的形成［9］。近年來研究醋酸西唑來汀，脊髓水平的CGRP和SP抑制劑，能明顯抑制尿動力診斷逼尿肌過度活動病人尿急和尿失禁癥狀［10］。

本實驗結果顯示:模型組大鼠脊髓背角內SP、CGRP免疫陽性神經(jīng)元均明顯增加(P＜0.01)。電針60 min后大鼠膀胱內SP免疫陽性神經(jīng)元較模型組明顯減少(P＜0.01)。推測電針次髎穴有可能通過抑制 Aδ和 C類傳入纖維投射所釋放的 SP、CGRP，減少感覺信號的傳遞，從而抑制逼尿肌過度活動。

神經(jīng)肽類表達的變化及在中央終端的釋放導致控制排尿脊髓環(huán)路重建，這種重建包括以下幾種變化:(1)脊髓排尿反射的突觸組合;(2)特殊神經(jīng)元單元的化學受體編碼(初級傳入神經(jīng)元，中間神經(jīng)元);(3)上行和下行脊髓反射投射組合方面。Aδ和C類傳入纖維與脊髓背角傷害性感受神經(jīng)元之間的突觸傳遞不僅可以強化，也可以產生長時程的抑制制(long-term depression，LTD)。給外周傳入纖維不同的條件刺激，在脊髓背角能產生不同的突觸傳遞可塑性變化。如對Aδ傳入神經(jīng)纖維進行低頻條件電刺激，在初級傳入纖維與脊髓背角傷害性感受神經(jīng)元之間形成的突觸傳遞則誘發(fā)LTD，而對C纖維進行高頻強直性條件電刺激則誘發(fā)LTD［11］;本實驗采用高頻電針治療，其作用機制可能與抑制C纖維的突觸傳遞抑制有關。

本研究結果提示，電針次髎穴可通過降低脊髓后角SP和CGRP的表達來抑制傳入神經(jīng)的興奮性及傳入遞質的合成與釋放、抑制C纖維的突觸傳遞而影響脊髓排尿環(huán)路、抑制逼尿肌過度活動降低膀胱基礎壓及降低排間期等方式治療OAB。

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Urodynamic effects of electroacupuncture at Ciliao on overactive bladder in rats and CGRP，SP expressions of dorsal horn of spinal cord

SUN Wei- bing1，YANG Fan1，QI Qing - hui2
(1.Department of Urology，the Second Affiliated Hospital of Dalian Medical University，Dalian116027，China;2.Department of General Surgery，the First Affiliated Hospital of Dalian Medical University，Dalian116011，China)

Abstract:［Objectives］To investigate the urodynamic effects of electroacupuncture at CiLiao(BL 32)on overactive bladder(OAB)in rats induced by cyclophsphamide(CYP)and expressions of calcitonin-gene related peptide(CGRP)and SP in dorsal horn of spinal cord.［Methods］Twenty five Sprague-Dawley rats were randomly divided into:control group(n=5)，chronic OAB group(n=10)，chronic OAB+electroacupuncture group(n=10).OAB model was established by intraperitoneal injection(i.p.i)of cyclophsphamide，continuous cystometry was performed to detectinter- contraction interval，basal，threshold，micturition voiding pressure before and after electroacupuncture.The expressions of CGRP and SP in the dorsal horn of spinal cord were detected by immunohistochemical method.［Results］Compared with control group，inter-contraction interval was decreased(P＜0.05)and basal pressure was increased(P＜0.01)in both OAB and ele-ctroacupuncture group before acupuncture.While basal pressure was decreased and inter-contraction interval was increased significantly in acupuncture group compared with those in control group(P ＜0.01).Comparison with control group，the mean optical density(OD)value of SP and CGRP positive products in the dorsal horn of sacral cord in OAB group was increased significantly(P ＜0.05)，while compared with OAB group，the mean OD value of SP and CGRP in acupuncture group was decreased(P ＜0.05).［Conclusions］Electroacupuncture at CiLiao could inhibit the overactive bladder induced by cyclophsphamide in rats by decreasing the SP and CGRP expressions in the dorsal horn of spinal cord.

Key words:electroacupuncture;overactive bladder;substance P;calcitonin gene-elated peptide;urodynamic

R277.5

A

1671-7295(2012)03-0220-05

遼寧省自然科學基金資助項目(20082205)

2012-02-15;

2012-04-23

孫衛(wèi)兵(1966-)，男，遼寧大連人，教授，主任醫(yī)師。E-mail:massurm@163.com

齊清會，教授。E -mail:qiqh@medmail.com.cn