組織塊法培養人胃成纖維細胞及其結締組織生長因子的表達

肖在鵬，史煉鋼，胡 祥，楊佩滿， 邵淑娟，胡 軍，趙瑾瑤

(1.大連市中心醫院 普外一科, 遼寧 大連 116033; 2. 大連醫科大學 附屬第一醫院 普外科, 遼寧 大連 116011 ; 3. 大連醫科大學 組織學胚胎學教研室, 遼寧 大連 116044)

成纖維細胞是結締組織中最常見的細胞，由胚胎時期的間充質細胞分化而來。電鏡下，成纖維細胞胞質內可見豐富的粗面內質網、游離核糖體和高爾基復合體，表明其具有合成和分泌蛋白質的功能。己知成纖維細胞的主要功能之一是合成膠原蛋白及其他細胞外基質，在組織器官纖維化過程中發揮重要作用。在纖維化疾病的研究中，原代培養成纖維細胞是基礎工作之一。成纖維細胞的原代培養方法可分為酶消化法和組織塊法，其中組織塊法因其操作簡便、條件易于控制而應用更為普遍，因此本研究采用組織塊法對人胃成纖維細胞進行原代培養，為進一步研究提供實驗材料。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

胎牛血清(TBD Company)；胰蛋白酶(Hyclone，USA)；DMEM培養基(Hyclone，USA)；RT-PCR試劑盒(Takara Company)；DNA Marker DL 2000 (Takara Company)；鼠抗人波形蛋白抗體(北京中山試劑公司)；鼠抗人角蛋白抗體(北京中山試劑公司)；TritonX-100(北京中山試劑公司)；FITC羊抗兔IgG (北京中山試劑公司)；羊抗小鼠SP免疫組化試劑盒(北京中山試劑公司)；人Connective Tissue Growth Factor (CTGF)多克隆抗體 (武漢博士德生物技術公司)；CO2細胞培養箱(Forma,USA)；倒置相差顯微鏡 (Olympus,Japan)；PCR 擴增儀(PE2400,USA)。

1.2 實驗方法

1.2.1 成纖維細胞的培養

采用組織塊貼壁法進行人胃成纖維細胞的原代培養，其步驟如下：取標本前征得患者及家屬同意，并通過倫理委員會批準。由手術臺上取得胃癌標本，立即于臺下無菌條件下，選擇遠離腫瘤部分(經病理檢查無腫瘤細胞)，嚴格切取胃壁的黏膜層，去除皮下脂肪組織，以生理鹽水沖洗去血后，于0.1%洗必泰溶液中浸洗2 min，再以生理鹽水反復沖洗去除洗必泰，置于盛有含100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素DMEM培養液的小玻璃瓶里(冰盒中)，盡快送入實驗室。在超凈臺上，將瓶內胃黏膜組織從瓶中轉移至無菌培養皿中，用生理鹽水沖洗標本3次。在培養皿中將胃黏膜組織切成適當大小的組織塊(1～2 mm3)，去掉脂肪組織。 另取一無菌培養皿，以眼科鑷將組織塊送入培養皿中擺好，組織塊間距約為5 mm。將無菌蓋玻片輕輕覆蓋在組織塊上，向培養皿內緩慢滴加少量含15%胎牛血清的DMEM培養液。 將培養皿置入CO2培養箱內，在37 ℃、5%CO2、飽和濕度下孵育3 h。 3 h后補加DMEM培養液約3 mL,繼續于培養箱內孵育。3 d后第1次換液，以后每3日換液1次。

1.2.2 成纖維細胞傳代培養、純化、凍存、復蘇

(1)成纖維細胞傳代培養：當從組織塊中游出的細胞鋪滿培養皿底約80%時，進行首次傳代，倒去原培養液，用PBS液洗1次棄去，加入0.25%胰蛋白酶1.5 mL消化細胞，待成纖維細胞出現胞質回縮、細胞變成圓球形、細胞間隙增大時傾去胰蛋白酶，加入含15%胎牛血清的DMEM培養液終止消化，用吸管從培養皿底一邊開始到另一邊結束，按順序吹打，吹打時動作要輕柔，盡量避免出現泡沫。將脫壁細胞制成細胞懸液，計數，調好細胞密度(0.5×105～1×105cell/mL)，將細胞懸液按1∶3接種于3個新的25 mL培養瓶中，并各補加培養液，然后置入37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件的培養箱中繼續培養，這時所得細胞多數為成纖維細胞，培養皿中沒有脫壁的主要是上皮細胞，傳至第3代可獲得足夠數量的人胃成纖維細胞用于實驗。

(2)人胃成纖維細胞的凍存：細胞消化后，將單細胞懸液轉移至10 mL離心管內，1000 r/min，離心5 min，棄上清，加入4 ℃預冷的凍存液(含15%胎牛血清的DMEM培養液、DMSO比例為9∶1)，將細胞重新混懸，分裝于1 mL凍存管內密封。先將凍存管置4 ℃冰箱0.5 h，然后移入-20 ℃冰箱2 h，再將凍存管置于-80 ℃冰箱內24 h后放入液氮罐內， -196 ℃長期保存。

(3)人胃成纖維細胞的復蘇：復蘇時將凍存管從液氮罐內取出，迅速放入37 ℃水浴中復溫(1 min)，吸出細胞懸液注入離心管并加入5 mL DMEM培養液，混勻后1000 r/min 離心5 min，傾去上清液，加入適量含15%胎牛血清的DMEM培養液重懸細胞，調細胞密度為1×106/mL，接種于培養瓶，置37 ℃、5%CO2培養箱內培養，第2天更換培養液1次，繼續培養。

1.2.3 成纖維細胞的鑒定

(1)相差顯微鏡下進行細胞形態學鑒定；(2)用抗波形蛋白、角蛋白的抗體對傳3 代及以上的細胞進行免疫細胞化學染色，完成成纖維細胞標記物鑒定，具體步驟詳見免疫組化試劑盒說明書。

1.2.4 RT-PCR法檢測人胃成纖維細胞CTGFmRNA表達

根據GenBank數據庫，用Primer-3軟件設計目的基因PCR擴增引物,由大連寶生物公司合成。CTGF:上游引物：5'- AAGTACCAGTGCACGTGCCTG -3';下游引物：5'- TGTAATGGCAGGCACAGGTC -3',擴增后片段長度為621 bp。β-actin: 上游引物：5'- TCGTCACCAACTGGGACGACATGG -3'；下游引物：5'- GATCTTGATCTTCATTGTGCTGGG -3'，擴增后片段長度為750 bp。參照TRIzol試劑的說明書提取總RNA，將提取的RNA逆轉錄為cDNA后作為模板用于PCR，反轉錄條件為：(1)50 ℃反應50 min; (2)95 ℃ 5 min滅活轉錄酶;(3) 5 ℃,5 min。應用50 μL PCR擴增體系，以細胞cDNA作為模板用于PCR，循環參數為：94 ℃預變性 5 min, 94 ℃變性 30 s, 55 ℃退火 30 s, 72 ℃延伸 45 s，30個循環，72 ℃ 再延伸10 min。反應結束后，1.5%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行電泳分析，用美國UVP 凝膠成像系統EC3 System觀察并照相記錄。

1.2.5 免疫細胞熒光染色法觀察人胃成纖維細胞中CTGF蛋白表達

應用CTGF多克隆抗體對傳3 代及以上的細胞進行免疫細胞熒光染色，觀察人胃成纖維細胞中CTGF蛋白表達情況，具體步驟詳見免疫組化試劑盒說明書。

2 結 果

2.1 組織塊法原代培養人胃成纖維細胞

組織塊貼壁后，經培養5～7 d，少量的成纖維細胞開始從組織塊四周游出，隨時間推移，游出的成纖維細胞逐漸增多，組織塊周圍可見大量成纖維細胞包繞，常有成纖維細胞和上皮樣細胞混雜生長，成纖維細胞生長旺盛，3～4周后，組織塊游出的單層細胞匯合，細胞接近鋪滿瓶底，可消化傳代。細胞純化、傳代、凍存同上(圖1)。

2.2 成纖維細胞的鑒定

2.2.1 倒置相差顯微鏡下觀察結果

選第3代生長的人胃成纖維細胞在倒置顯微鏡下觀察，細胞呈長梭形或星形，體積大小不一，胞體狹長、透亮，胞核呈橢圓形，位于細胞中央，胞漿豐富，胞膜清晰，至匯合時，細胞排列密集，細胞界限不清，呈放射狀或旋渦狀走行，大小基本一致，排列有一定的方向性(圖2)。

圖1 人胃成纖維細胞從組織塊周圍游出Fig1 The human gastric fibroblasts grow from the tissue explant

2.2.2 免疫細胞化學染色結果

培養細胞經免疫細胞化學染色顯示：波形蛋白染色陽性，胞漿內見大量棕黃色顆粒,襯染的核呈藍色；細胞角蛋白染色陰性，符合培養條件下成纖維細胞的細胞標記特征(圖3、4)。

圖3 體外培養的人胃成纖維細胞波型蛋白表達陽性(免疫細胞化學染色方法)

圖4 體外培養的人胃成纖維細胞角蛋白表達陰性(免疫細胞化學染色方法)

2.3 RT-PCR檢測人胃成纖維細胞CTGFmRNA表達情況

從第3代培養細胞中提出的RNA純度較高，紫外分光計測定所提取的RNA OD260/OD280值為1.8～2.0,PCR反應產物經瓊脂糖凝膠電泳分離，紫外透射儀下觀察發現每個反應產物有一條特異性條帶，與DNA分子量標準相比較，分別為621 bp(CTGF)和750 bp(β-actin)，與預想結果一致(圖5)。

圖5 體外培養的人胃成纖維細胞表達CTGFmRNA(1、2為CTGF，3、4為β-actin，5為Marker)

2.4 免疫細胞熒光染色法觀察人胃成纖維細胞中CTGF蛋白表達情況

熒光顯微鏡下培養細胞的細胞質中可見黃綠色熒光，呈現陽性反應，人胃成纖維細胞表達CTGF蛋白(圖6)。

圖6 體外培養的人胃成纖維細胞表達CTGF蛋白(免疫細胞熒光染色方法)

3 討 論

原代培養是指細胞自機體分離之后至第1次傳代之前的細胞培養階段，可分為3個步驟：(1)分離組織；(2)解離組織塊；(3)接種于培養器皿中培養。自組織分離之后，原代細胞培養可分為兩種：一種是將組織塊用機械法或酶消化法處理，此方法可以很快得到大量活細胞，細胞也可在短時間內生長成片，原代細胞產量高。酶消化法的缺點是消化酶損傷細胞，因此消化酶濃度、處理溫度和處理時間非常重要，同時消化酶的活力變異很大，細胞消化程度的判斷很大程度上取決于個人的經驗，掌握起來很困難，無法形成一個明確的操作規范。另一種是將組織塊貼附于適宜的基質上，細胞自組織塊向外遷移生長。此方法雖然獲取細胞所需周期長，不是每個組織塊都能長出細胞，不能在短時間內獲取大量細胞，但其在很大程度上保持了原有組織結構，有利于細胞適應體外培養環境。組織塊法簡單、實用，只要實驗方法正確，持之以恒，必定成功。

本實驗選擇組織塊法分離培養人胃成纖維細胞，較經典組織塊法改進了1處：切取標本后先以生理鹽水沖洗去血，再以0.1%洗必泰浸洗消毒殺菌。本實驗開始時細胞污染率居高不下，反復思索后方明白其中緣由，正常人胃黏膜表面存在多種細菌，如不處理，離體培養人胃成纖維細胞污染率必定很高，所以實驗過程中加0.1%洗必泰浸洗，再以生理鹽水沖洗去洗必泰，大大降低了細胞污染率。無菌操作是原代細胞培養的關鍵，一切操作應同手術操作一樣，嚴格要求無菌處理。

在原代細胞早期培養階段，經常見到成纖維細胞和上皮細胞混雜生長，根據這兩種細胞對胰蛋白酶耐受性不同，成纖維細胞對酶性分離敏感，胰酶消化時成纖維細胞先脫壁，而上皮樣細胞需要消化較長時間才能夠脫壁，而且接種后成纖維細胞貼壁展開也較快，而上皮細胞在短時間內不能貼附或貼附不牢，這樣根據這一特征采用差別消化及反復貼壁的辦法，去除上皮細胞和其它細胞，可獲取純化的成纖維細胞。本實驗采用3～6代處于對數生長期的人胃成纖維細胞。

成纖維細胞是結締組織中最主要的細胞類型，其基本功能是合成和分泌各型膠原蛋白，從而形成膠原纖維，成纖維細胞也能分泌彈性蛋白等其它細胞外基質成分。成纖維細胞中間絲的結構蛋白為波形蛋白，不同于上皮細胞的角蛋白，成為不同種類細胞分類鑒定的相對特異性標志。本實驗的免疫細胞化學染色結果顯示，培養的細胞表達波形蛋白，不表達角蛋白，這說明本實驗培養的細胞為人胃成纖維細胞。

本研究在體外成功地進行了人胃成纖維細胞的分離、培養和傳代，并從形態學、免疫細胞化學等方面對細胞進行了鑒定，為后續的研究提供了穩定的細胞模型。

在本實驗中，用RT-PCR和免疫熒光染色方法檢測了體外培養的處于指數增生期的人胃成纖維細胞中CTGFmRNA和蛋白的表達情況，發現人胃成纖維細胞自身能合成、分泌CTGF，是胃癌組織中CTGF的來源之一。自分泌是生長因子的一種重要的分泌方式，自分泌細胞在產生生長因子的同時，產生了該生長因子的受體，從而作用于自身細胞，成纖維細胞可自分泌轉化生長因子β1(TGF-β1)、表皮生長因子(EGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)等[1-2]。其中TGF-β1自分泌廣泛存在于各種成纖維細胞，與成纖維細胞增殖、分化以及組織器官纖維化的發生、發展密切相關[3-5]。研究發現在CTGF基因啟動子序列-162 bp和-128 bp之間存在著TGFβ應答元件TβRE/BCE-1,不存在于CCN家族其它成員或TGFβ誘導的其它基因啟動子中，提示TGFβ誘導CTGF表達具有特異性，其在CTGF基礎表達的調節中起重要作用[6-7]。TGFβ主要通過SMAD3/SMAD4依賴途徑，蛋白激酶C(PKC)和Ras/MEK/ERK信號傳導途徑誘導CTGF表達[8-10]。因此，可推測人胃成纖維細胞自身分泌的TGF-β誘導了CTGF的表達。

本實驗結果表明活化增生的人胃成纖維細胞能合成CTGF，通過自分泌、旁分泌途徑作用于自身，為進一步研究CTGF與人胃成纖維細胞的關系提供了實驗基礎。

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