Rad18缺失對雄小鼠生殖細胞的影響

孫婧華，劉立峰

(1.大連醫科大學 附屬第二醫院 腫瘤內科， 遼寧 大連 116027；2.大連醫科大學 附屬第一醫院 婦產科，遼寧 大連 116011)

紫外照射、生殖毒素能引起多種DNA損傷。DNA損傷后在復制期引起復制叉不穩定從而導致細胞死亡。復制后修復(postreplication repair, PRR)能不去除損傷模板而恢復DNA復制。該種修復在多種物種中可見，主要包括以下3個過程：損傷DNA合成 (TLS)、重組和模板轉換[1]。

芽殖酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，Rad6 epistasis家族參與復制后修復過程。其中編碼泛素結合酶E2和泛素連接酶E3的Rad6和18在PRR中起關鍵作用[2]。Stelter[3]指出Rad6/Rad18決定復制后修復PCNA泛素化。目前，人的細胞中已鑒定出一個Rad18同源物(hRad18)[4]和兩個Rad6同源物(HHR6A和HHR6B)[5]。hRad18和mRad18在PRR通過PCNA單或多泛素化而維持基因信息穩定[4,6]。小鼠中，mRAD18在胚胎干細胞(mouse embryonic stem cells, mESCs)和成年小鼠睪丸粗線期精母細胞中高表達[6-7]，定位于XY體[7-8]。Roest等[9]報道mRad6B敲除雄小鼠在減數分裂后染色體重塑過程受損而不育，認為mRad18對精子發生起重要作用。本文利用Rad18-/-小鼠模型研究Rad18缺失對雄小鼠生殖細胞的影響。

1 材料和方法

1.1 材 料

動物：C57BL/6J 野生小鼠(wild-type,WT)和Rad18-/-雄小鼠，來源于日本熊本大學動物實驗中心。1、6周齡WT雄小鼠各3只， 2、6、12月齡的WT和Rad18-/-雄小鼠各5只。

抗體和試劑：生殖細胞特異標記物TRA98一抗購自Bioacademia公司；二抗VECTASTAIN試劑盒購自Vector Laboratories公司。Rad18一抗來源于日本熊本大學組織制御實驗室；二抗購自Jackson ImmunoResearch公司。TSA plus 生物素體系信號放大NEL700購自Perkin-Elmer公司，DAB顯色檢測購自Roche公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 生精小管及附睪中生殖細胞的檢測：取2、6、12月齡WT和Rad18-/-雄小鼠各5只，取睪丸和附睪，于Bouin’s 固定液室溫固定4 h，經梯度酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋。切片：厚度為4 μm。采用常用步驟行TRA98免疫組織化學檢測。TRA98陽性(棕色)為精原細胞，精母細胞，圓形精細胞，陰性(藍色)為延長的精細胞和體細胞。

1.2.2 退化睪丸生精小管分類：根據退化管中TRA98標記的不同種類生殖細胞存在情況，將生精小管分為5類。0: 僅存在Sertoli細胞或同時存在拉長的精細胞；I: 存在Sertoli細胞和精細胞(包括圓形和拉長)，II: 存在Sertoli細胞、精母細胞和精細胞；III: 存在Sertoli細胞、精原細胞和精母細胞；IV:正常結構。分別計數分布情況并制圖。

1.2.3 生殖細胞中Rad18表達的檢測：取1、6周齡各3只WT雄小鼠睪丸，于4%多聚甲醛中4 ℃固定過夜。甲基丙烯酸甲酯包埋，切片：厚度為5 μm。采用常用步驟行Rad18免疫組織化學檢測。

1.2.4 原位雜交：組織切片同Rad18檢測切片，利用mRad18 cDNA 的OFR區上的471堿基cDNA片段制成Rad18反義和正義探針。原位雜交采用Tadokoro的方法[10]。

1.3 統計學方法

2 結 果

2.1 Rad18-/-雄小鼠生殖細胞檢測

Rad18-/-小鼠睪丸組織切片HE染色發現Rad18-/-雄小鼠隨年齡增加，睪丸組織中生精小管退化。應用生殖細胞特異標記物TRA98檢測退化生精小管中生殖細胞表達，結果見圖1。與WT小鼠睪丸類似，12月齡Rad18-/-雄小鼠睪丸表面正常生精小管中含有精子生成過程中的生殖系細胞：精原細胞、精母細胞、圓形和拉長的精細胞以及精子。相反，同一睪丸的退化小管中，TRA98陽性生殖系細胞分布異常。

2.2 Rad18-/-雄小鼠隨年齡增長精原細胞的變化

2、6、12月齡WT小鼠睪丸組織中正常生精小管(第IV類)比例無明顯變化(圖2A)，分別為97.00%、97.54%和96.82%；但2、6、12月齡Rad18-/-小鼠睪丸組織中正常生精小管比例明顯下降(圖2B)，分別為99.42%、83.79%和58.54%，兩組相比差異有顯著性意義(P<0.05)；同時，Rad18-/-小鼠睪丸組織中第0、I 和II類異常生精小管比例均隨著年齡增長而逐漸增高，2、6、12月齡時，這3類異常結構比例總和為：0.58%、15.08%和39.50%(圖2B)，而2、6、12月齡WT小鼠中總和分別為0.70%、1.99%和2.76%(圖2A)，這3類異常結構的共同特點即缺乏含有精原干細胞的精原細胞，12月齡Rad18-/-雄小鼠39.50%的生精小管中缺失早期精原細胞，與WT小鼠的2.76%比較差異有顯著性意義(P<0.05)；WT和Rad18-/-小鼠中第III類異常小管比例均無顯著變化(圖2)。

2.3 12月齡Rad18-/-雄小鼠精子形態

雖然12月齡Rad18-/-雄小鼠39.5%的生精小管中缺失早期精原細胞，但在附睪中的精子形態與WT相比未見異常，未見TRA98陽性未完成分化的生殖細胞提前釋放，見圖3。圖1C-F中可見形態正常的Sertoli細胞。

圖1 12月齡Rad18-/-小鼠睪丸中生殖細胞特異性標記TRA98的表達 ×400Fig 1 Expression of germ line cell-specific marker TRA98 in 12-month-old Rad18-/- testes ×400A：12月齡WT小鼠生精小管；B：12月齡Rad18-/小鼠正常生精小管；C-F:12月齡Rad18-/-小鼠退化生精小管

圖2 根據生殖細胞存在情況小鼠生精小管分類及分布Fig 2 Distribution of the seminiferous tubules showing each category of germline cellsA：WT小鼠 B：Rad18-/-小鼠

圖3 Rad18-/-小鼠附睪中未見TRA98陽性生殖細胞 ×400Fig 3 The spermatozoa in the epididymis of 12-month-old Rad18-/- mice displayed normal morphology ×400 A：WT小鼠 B：Rad18-/-小鼠

2.4 Rad18在野生雄小鼠精原細胞中的表達

在6周齡WT雄小鼠生精小管中，Rad18蛋白在精母細胞中表達，尤其定位在XY體上。Rad18蛋白在精原細胞細胞核中表達。原位雜交顯示Rad18 mRNA在精原細胞和精母細胞都表達。1周齡WT小鼠精原細胞處于未分化精原細胞增殖激活狀態，免疫組化結果顯示1周齡WT小鼠睪丸中的精原細胞核中表達Rad18蛋白，見圖4。

3 討 論

多項研究表明，RAD18不但參與了PRR[11]，而且參與了DNA損傷誘導基因的轉錄調節[12]、DNA損傷信號的傳導[13]，也參與了DNA單鏈斷裂和斷裂的修復[14-17]。Miyase等[18]報道Rad18-/-小鼠細胞中有明顯的復制后修復缺陷。Rad18敲除的mESCs對多種遺傳毒素試劑敏感，異常重組頻率提高，說明RAD18對維持細胞基因組穩定起重要的作用[7]。作者已經建立了Rad18-/-小鼠模型，該小鼠出生、成長正常，但隨年齡增加雄小鼠生育力下降，睪丸重量減輕，生精小管退化、生殖細胞丟失，并且研究表明這種退化不是因激素變化而引起。

圖4 Rad18蛋白和mRNA在WT小鼠睪丸中的表達Fig 4 The expression of Rad18 in WT mice

本研究應用免疫組織化學方法檢測生殖細胞特異標記物TRA98在2、6、12月齡Rad18-/-雄小鼠生精小管生殖細胞中的表達和分布，發現伴隨著正常生精小管比例的下降，缺乏精原細胞的退化小管比例增加，12月齡時已達39.50%，與同齡WT小鼠2.76%相比差異有顯著意義，與此同時，退化小管中仍可見處于不同分化階段的生殖細胞：精母細胞、圓形和拉長的精細胞以及精子，并且Sertoli細胞形態正常，附睪中未見異常生殖細胞，提示已分化的生殖細胞可完成精子形成，精原細胞的耗盡導致Rad18-/-雄小鼠生育力下降。

精原細胞中存在精原干細胞，精原干細胞整倍性維持對遺傳信息傳遞起關鍵作用。研究已表明，多種DNA損傷修復機制參與了干細胞的維持，包括非同源末端連接(NHEJ)和核苷酸切除修復(NER)[19-20]。DNA連接酶IV 介導的NHEJ 完成DNA雙鏈斷裂修復。隨年齡增加，DNA連接酶IV次形態突變(Lig4Y288C)引起小鼠造血干細胞和骨髓細胞逐漸丟失，嚴重影響了組織培養和移植中干細胞功能[23]。運動失調性毛細血管擴張癥(Atm)突變基因通過激活DNA修復中細胞周期關鍵蛋白維持基因組穩定。Atm突變小鼠24周出現因造血干細胞缺陷而導致的骨髓缺陷[21]。Takubo等[22]發現Atm-null小鼠睪丸中逐漸失去減數分裂前生殖細胞。因此，DNA修復機制對于維持干細胞整倍性和遺傳信息傳遞起關鍵作用。

盡管Rad18蛋白在成年睪丸精母細胞中高表達，但是本研究檢測到Rad18轉錄水平在精原細胞而非精母細胞高表達。此外，1周齡WT小鼠睪丸中未分化精原細胞表達Rad18蛋白，說明Rad18在增殖的未分化精原細胞具有活性。在Rad18-/-小鼠睪丸中，由于Rad18功能喪失，DNA損傷加劇，隨著年齡增加內源性DNA損傷或基因組重排可能加速精原細胞增殖，導致長期細胞周期阻滯，精原干細胞耗盡。

本研究結果提示，Rad18參與維持DNA復制中基因組DNA整倍性，對精原干細胞維持起重要作用。

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