亞低溫對大鼠短暫性全腦缺血后APE/Ref-1表達、神經元凋亡的影響

汪效松，雷惠新，張 旭，李智文，張志堅

( 1.福建醫科大學 省立臨床醫學院 福建省立醫院 神經內科，福建 福州 350001；2.福建省神經病學研究所，福建 福州 350005)

缺血/再灌注后神經元存在著由ROS(活性氧)引起的氧化性DNA損傷，可繼發凋亡[1]。APE/Ref-1 蛋白是一種多功能蛋白，其內所含的AP核酸內切酶是ROS氧化性DNA損傷修復過程中的限速酶，具有堿基切除修復功能，可針對此損傷過程進行基因修復；此外，它又參與氧化還原反應調控多種轉錄因子(AP-1、核因子κB等)的DNA結合活性，發揮轉錄因子的作用[2]。亞低溫是目前存在的對試驗性腦缺血損害最有效的治療方法[3-4],但其機理仍有許多不明之處。本研究旨在建立大鼠短暫性全腦缺血模型,觀察亞低溫對缺血敏感的海馬區神經元凋亡及APE/Ref-1蛋白表達的影響,試對亞低溫的腦保護機理作進一步探索。

1 材料和方法

1.1 實驗對象及分組

健康清潔級雄性SD大鼠56只(由上海西普爾—必凱實驗動物有限公司提供)，體重300～350 g，隨機分為3組: (1)假手術組8只；(2)常溫缺血組：分缺血10 min后常溫下存活1、2、3 d 3組，每組8只，共24只；(3)亞低溫缺血組：分缺血10 min后亞低溫3 h,存活1、2、3 d 3組。每組8只，共24只。

1.2 儀 器

動物解剖學顯微鏡(型號SZ40，Olympus公司)；光學顯微鏡(型號CH20-BIM，Olympus公司)；BL-310生物機能實驗系統(成都泰盟電子有限公司)。

1.3 試 劑

原位細胞凋亡檢測試劑盒(德國寶靈曼公司)；APE/Ref-1抗體(北京中山生物技術有限公司)；SP試劑盒(福州邁新生物工程公司提供)。

1.4 溫度控制

采用Maier等[5]的肛溫監控方法。先取6只SD大鼠,同時監測大鼠腦溫、肛溫,求得腦溫與肛溫的相關方程,Y=0.946X+3.1334,其中,Y為腦溫(℃),X為肛溫(℃) (相關系數r=0.988,P<0.01)。以此方程校正大鼠的腦溫與肛溫的差別,從而確定后繼實驗中亞低溫時相應的肛溫。根據上述方法,進行大鼠溫度控制。常溫缺血組: 保持肛溫35.8℃(相當于腦溫37℃)；亞低溫缺血組: 在缺血后立即采用噴灑酒精+電扇降溫,在10 min內使肛溫降至31.57℃(相當于腦溫33℃),并維持3 h,而后使其體溫回升至正常(肛溫35.8℃,腦溫37℃)。

1.5 方 法

采用“雙側頸總動脈阻斷+低血壓法”建立大鼠短暫全腦缺血模型[6]。大鼠用戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔麻醉，分離雙側頸總動脈及股動靜脈，進行股動靜脈置管，股動脈導管連接血壓換能器監測血壓。手術組(包括常溫缺血組和亞低溫缺血組)自股靜脈導管抽血，使平均動脈壓降至35 mmHg左右。動脈夾夾閉雙側頸總動脈10 min，維持平均動脈壓在(35±2.5)mmHg。缺血完畢立即將血自股靜脈回輸。假手術組只行血管分離，不予夾閉與抽血。

將各時間組大鼠再次麻醉，行腦灌注固定，石蠟包埋，腦海馬冠狀面6～8 μm連續切片。

3組切片均用免疫組化SP法檢測海馬神經元中APE/Ref-1的表達(DAB顯色)。用PBS代替一抗作陰性對照。3組切片均行TUNEL染色。用不含A液的TUNEL反應液作陰性對照。常溫缺血2 d組的切片行APE/Ref-1蛋白免疫組化與TUNEL雙重染色，蘇木素復染。

1.6 結果判定標準

光學顯微鏡下觀察的結果判斷標準：細胞核中有棕黃色顆粒者為APE/Ref-1陽性細胞；細胞核有紫黑色顆粒者為凋亡陽性細胞；細胞核被復染成淺藍色為既非APE/Ref-1陽性又非TUNEL陽性的細胞。每張切片高倍鏡下(×400)均計數大鼠腦海馬雙側CA1區各5個視野，結果用均數±標準差表示。以假手術組APE/Ref-1免疫組化陽性神經元數作為海馬正常神經元數，各組陽性神經元數與之相比即為各組陽性神經元占正常的百分比。

1.7 統計學方法

2 結 果

2.1 APE/Ref-1免疫組織化學染色結果

假手術組大鼠海馬CA1區神經元廣泛表達APE/Ref-1(圖1)。在常溫缺血后的1 d，海馬CA1區APE/Ref-1陽性細胞開始減少，2 d時減少明顯，3 d時僅余少許(圖2)。亞低溫缺血后的2 d，海馬CA1區APE/Ref-1陽性細胞數目開始減少，3 d時，減少程度有所增加(圖3)。與常溫缺血組相比，亞低溫缺血組在各時間點上APE/Ref-1 陽性細胞數目差異均有顯著性意義(表1)。

圖1 假手術組大鼠海馬CA1區APE/Ref-1蛋白在神經元胞核中廣泛表達(SP ×400)

圖2 常溫缺血組(存活3 d)大鼠海馬CA1區APE/Ref-1蛋白表達明顯減少 (SP ×400)

2.2 TUNEL 染色結果

假手術組和缺血后存活1 d 組未發現TUNEL染色陽性神經元, 缺血后存活2 d 及3 d 的常溫缺血組海馬CA1 區TUNEL陽性神經元較同時間亞低溫缺血組的陽性神經元數目增多(P<0.01)(圖4、5)。溫度不同時各時間點大鼠腦海馬CA1區陽性神經元數見表2。

圖3 亞低溫缺血組(存活3 d)海馬CA1區APE/Ref-1陽性神經元 (SP ×400)

表1 常溫組與亞低溫組大鼠海馬CA1區不同存活時間APE/Ref-1陽性神經元數比較

1)與亞低溫組比較，P<0.01

圖4 常溫缺血組(存活3 d)大鼠海馬CA1區大量TUNEL陽性神經元 (TUNEL染色 × 400)

2.3 APE/Ref-1蛋白免疫組化與TUNEL雙重染色

缺血后2 d腦組織切片行APE/Ref-1蛋白免疫組化和TUNEL雙重染色可觀察到3種不同細胞：APE/Ref-1陽性細胞、TUNEL陽性細胞及既無APE/Ref-1陽性又無TUNEL陽性的細胞。未見TUNEL陽性與APE/Ref-1陽性同處于一個細胞中(圖6)。

圖5 亞低溫缺血組(存活3 d)海馬CA1區僅可見少許TUNEL染色陽性的神經元(TUNEL染色 × 400)

表2 常溫組與亞低溫組大鼠海馬CA1區不同存活時間TUNEL陽性神經元數比較

1)與亞低溫組比較，P<0.01

圖6 常溫缺血組(存活2 d)大鼠海馬CA1區APE/Ref-1蛋白免疫組化與TUNEL雙重染色 ×400

2.4 不同溫度全腦缺血后APE/Ref-1的變化與神經元凋亡的關系

以上文得出的表1部分和表2部分中不同溫度下的APE/Ref-1陽性細胞百分比與TUNEL陽性細胞百分比值為依據，作出不同溫度下短暫性全腦缺血后海馬CA1區APE/Ref-1陽性細胞百分比與TUNEL陽性細胞百分比隨時間變化圖，見圖7、8。

圖7 海馬CA1區常溫缺血后APE/Ref-1陽性細胞與TUNEL陽性細胞時間變化圖

圖8 海馬CA1區亞低溫缺血后APE/Ref-1陽性細胞與TUNEL陽性細胞時間變化圖

3 討 論

研究發現，缺血性腦中風發生早期，缺血中心區腦血流急劇下降，神經細胞死亡以壞死為主；而缺血中心區周圍(缺血半暗帶)的神經細胞仍然具有代謝活力，其后續的死亡以凋亡為主，其形態學表現為核固縮、胞膜發泡及凋亡小體的形成，DNA在寡核小體間裂解，在凝膠電泳時呈現明顯的“DNA Ladder”[7]。

APE/Ref-1蛋白被認為是自身DNA修復機制中的關鍵成分，具有DNA堿基切除修復功能[8]，在腦缺血時，能修復損傷的神經元DNA，防止凋亡的發生。APE/Ref-1蛋白減少，會使得部分DNA損傷后不能得到有效的修復，導致細胞凋亡的發生。既往研究表明，APE/Ref-1蛋白表達下調的細胞，對誘發DNA損傷的各種因素敏感性增強[9]。

本研究顯示，10 min的短暫性全腦缺血/再灌注引致的神經元死亡主要表現為對缺血敏感的海馬CA1區巨錐體細胞的遲發性死亡。這種遲發性神經元死亡主要為凋亡，發生在缺血后的2～3 d，以3 d時明顯。正常情況下，APE/Ref-1蛋白在海馬神經元細胞核中廣泛表達。缺血后1 d，已可觀察到海馬CA1區APE/Ref-1蛋白陽性細胞開始減少，2 d減少明顯，3 d僅存少許。從缺血時間與陽性細胞百分比圖可以看出海馬CA1區APE/Ref-1蛋白的減少和TUNEL陽性細胞增多明顯相關。APE/Ref-1蛋白的減少要早于TUNEL陽性細胞數增多。缺血后2 d腦組織同一張片上APE/Ref-1蛋白免疫組化和TUNEL雙重染色可觀察到APE/Ref-1陽性細胞、TUNEL陽性細胞及既無APE/Ref-1陽性又無TUNEL陽性的細胞，未見TUNEL陽性與APE/Ref-1陽性同處于一個細胞中。這既說明APE/Ref-1的減少要早于凋亡細胞的出現，又提示失去APE/Ref-1陽性的細胞轉變為TUNEL陽性細胞。

亞低溫是目前缺血后腦損傷最有效的保護措施之一[3-4]。大量的研究表明，亞低溫起效的機制是多重性的，它能在多個水平上阻止腦梗死后缺血級聯反應的發展，從而減少神經元壞死和凋亡，抵抗腦缺血再灌注損傷，持久的保護神經元形態和功能免受損害[10-11]。

本實驗顯示,與常溫缺血組相比,實行亞低溫的大鼠海馬CA1區中APE/Ref-1 染色陽性的神經元數目在缺血后減少不明顯, 再結合TUNEL 染色結果,亞低溫同時也抑制神經元的凋亡。而如上述，在腦缺血后APE/Ref-1的減少要早于凋亡細胞的出現，且失去APE/Ref-1陽性的細胞轉變為TUNEL陽性細胞。因此，亞低溫可能通過對APE/Ref-1蛋白的保護而抑制神經元的凋亡。

APE/Ref-1蛋白被認為是自身DNA修復機制中的關鍵成分，因此，從本實驗可以推測亞低溫可能對缺血后神經元自身DNA修復機制有保護作用，且可能通過對此機制的保護而抑制神經元的凋亡。

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