反義TIMP-1基因轉染對肺纖維化大鼠肺組織TIMP-1和Ⅰ型膠原表達的影響

唐海英，毛靖偉，秦 宇，吳泰華

(1．大連醫科大學 附屬第一醫院 呼吸內科，遼寧 大連 116011； 2．大連醫科大學 附屬第一醫院 消化內科，遼寧 大連 116011； 3．大連醫科大學 附屬第一醫院 干部病房，遼寧 大連 116011)

肺纖維化是多種慢性肺部疾病的病理過程，臨床表現為進行性肺功能損害，死亡率高，嚴重威脅人類的健康和生命。致病因素造成各種急性和慢性肺損傷后，引起細胞外基質(extracellularmatrix，ECM)成分及量的改變，ECM在肺中病理性沉積，造成肺功能異常的重要因素。

ECM的積聚在肺纖維化的發生和發展中起著非常重要的作用[1-4]，然而目前尚無有效方法阻止ECM的積聚。近年來，眾多學者認為肺纖維化是ECM合成和降解不平衡的結果，而降解減弱是引起ECM積聚的重要因素。因此ECM降解減弱在肺、腎、肝等重要臟器纖維化發生中的作用非常關鍵[5-6]。本文以博來霉素(BLM)誘導的肺纖維化大鼠為模型，并應用反義核酸技術，將正、反義TIMP-1的表達質粒轉染到不同階段肺纖維化大鼠模型肺內，觀察內源性TIMP-1 的表達變化及肺組織病理形態學變化，了解其對實驗性大鼠肺纖維化TIMP-1和Ⅰ型膠原基因和蛋白表達的影響，為基因治療在將來臨床肺纖維化治療中的應用奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材 料

清潔級6周齡雌性SD(Sprague-Dawley)大鼠，共210只，體重180～220 g，由遼寧省大連醫科大學SPF動物重點實驗室提供；BLM購自日本化藥公司；含正、反義人TIMP-1cDNA逆轉錄病毒載體及空載體的細胞上清由本實驗室構建[8]；Trizol試劑購自Invitrogen公司；TIMP-1和Ⅰ型膠原引物由大連寶生物公司合成；TaKaRa RNA PCR kit 3.0(AMV)試劑盒購自大連寶生物公司；羊抗鼠TIMP-1多克隆抗體購自美國RD公司；羊抗鼠Ⅰ型膠原抗體購自Santa Cruz生物公司；兔抗山羊SP試劑盒購自福州邁新生物公司； DAB顯色試劑盒購自福州邁新公司。

1.2 方 法

1.2.1 分 組：將SD大鼠隨機分為5組，T1組(正義TIMP-1轉染組)、T2組(反義TIMP-1轉染組)、T3組(空載體轉染組)以及C組(正常對照組)、C1組(肺纖維化組)，每組SD大鼠42只。

1.2.2 實驗方法：T1組、T2組、T3組和C1組大鼠先制作成肺纖維化模型, 具體的方法為：經乙醚麻醉后，頸前暴露氣管，一次性氣管內注0.4%的BLM生理鹽水注射液(5 mg/kg) ，制成動物模型；C組不給予任何干預措施；T1、T2、T3組為分別在給予BLM后第1, 3, 7, 14, 28, 60, 90天將含正、反義人TIMP - 1cDNA逆轉錄病毒載體、空載體導入肺纖維化大鼠肺內，分別在轉染后28 d處死大鼠； C1組僅給予BLM， 時間與轉染組相同；取大鼠右肺迅速置于液氮中凍存，用于RNA提取和RT-PCR；取大鼠左肺于10%甲醛溶液固定，用于病理形態學觀察和免疫組織化學分析。

1.2.3 病理形態學觀察：取大鼠左肺石蠟包埋10%甲醛溶液固定肺組織，切片，蘇木素-伊紅(HE)和Masson三色染色。

1.2.4 RT-PCR檢測及產物定量：按照TRIzol的試劑說明書提取總RNA，根據TaKaRa RNA PCR kit3.0(AMV)試劑盒說明書進行RT-PCR反應。引物由大連寶生物公司合成，引物如表1。PCR反應條件：TIMP-1， 94℃，1 min；51℃，1 min；72℃，90 s；Ⅰ型膠原：94℃，30 s；55℃，30 s；72℃，1 min； β-actin，94℃，30 s；55℃，30 s；72℃，1 min；各30個循環。RT-PCR產物在2%瓊脂糖凝膠上進行電泳后采用凝膠成像系統做積分吸光度(A值)測定，并以各組目的基因與內參照β-actin的比值的變化來衡量各組不同階段肺組織TIMP-1mRNA 和Ⅰ型膠原mRNA表達的相對變化。

表1 目的基因引物序列Tab 1 Oligonucleotide sequences of target gene primers

1.2.5 免疫組織化學檢測及圖像分析：利用免疫組織化學方法分析TIMP-1、Ⅰ型膠原蛋白的表達變化，常規免疫組織化學法處理玻片，所加一抗為羊抗鼠TIMP-1多克隆抗體，效價1∶5和羊抗鼠Ⅰ型膠原抗體，效價1∶100，然后按SP試劑盒說明進行免疫組織化學染色。利用Image-pro plus 4.5顯微鏡圖像分析系統對染色陽性物質進行光密度測定。以高倍鏡(×400)在每張切片上隨機選取5個視野，測定陽性部位總光密度值和總面積值，計算二者比值即陽性表達部位的平均光密度值，該值越大，表明蛋白表達量越高。

1.3 統計學方法

2 結 果

2.1 光鏡下病理形態學觀察結果

2.1.1 HE染色：正常對照組大鼠肺組織支氣管及肺泡結構正常；給予BLM后第1、3天T2組與同一時間點的C1組和T3組比較肺組織結構較完整，肺泡間隔增厚及間質內成纖維細胞增生減輕。而T1組肺組織結構破壞，纖維組織增生明顯(圖1)。給予BLM后第7、14、28、60、90天T1和T2組與同一時間點的C1、T3組比較無明顯不同。不同階段進行空載體轉染與同一時間點的肺纖維化組比較無明顯變化。

圖1 給予BLM后第1、3天進行轉染的光鏡下病理形態學改變(HE染色×200)Fig 1 Lung tissue pathological changes under microscope after being transfected following the intratracheal injection of BLM on days 1, 3 (HE staining×200 )

2.1.2 Masson三色染色法：給予BLM后第1、3天T2組與同一時間點的C1組和T3組比較膠原纖維明顯減少。而T1組膠原纖維增加(圖2)。給予BLM后第7、14、28、60、90天T1和T2組與同一時間點的C1和T3組比較無明顯不同。不同階段進行空載體轉染與同一時間點的肺纖維化組比較無明顯變化。

圖2 給予BLM后第1、3天進行轉染的光鏡下病理形態學改變(Masson染色×200)Fig 2 Lung tissue pathological changes under microscope after being transfected following the intratracheal injection of BLM on days 1, 3 (Mason staining×200)

2.2 RT-PCR結果

給予BLM后第1、3天T2組與同一時間點的C1和T3組比較TIMP- 1和Ⅰ型膠原表達減弱(P<0.05)，且T2組TIMP- 1和Ⅰ型膠原表達仍高于C組(P<0.05)。而T1組表達增加(P<0.05)。給予BLM后第7、14、28、60、90天T1和T2組兩指標的表達與同一時間點的C1組、T3組比較無明顯不同(P>0.05)。見表2、3。

表2 不同時間肺組織中TIMP-1 mRNA的表達變化 Tab 2 Lung TIMP-1 mRNA expression at different time-points

T1(正義TIMP-1轉染組)、T2(反義TIMP-1轉染組)、T3(空載體轉染組)、C(正常對照組)、C1(肺纖維化組)；1)與同一時間點C1組及T3組比較，P<0.05；2)與C組比較，P<0.05

表3 不同時間肺組織中I 型膠原mRNA表達的變化 Tab 3 Lung type I collagen mRNA expression at different time-points

T1(正義TIMP-1轉染組)、T2(反義TIMP-1轉染組)、T3(空載體轉染組)、C(正常對照組)、C1(肺纖維化組)；1)與同一時間點C1組及T3組比較，P<0.05；2)與C組比較，P<0.05

2.3 免疫組織化學結果

給予BLM后第1、3天T2組與同一時間點的C1組及T3組比較TIMP- 1和Ⅰ型膠原蛋白表達減弱(P<0.05)。T1組TIMP- 1和Ⅰ型膠原蛋白表達增加(P<0.05)，且T2組TIMP- 1蛋白和Ⅰ型膠原表達仍高于正常對照組(P<0.05)。給予BLM后第7、14、28、60、90天T1和T2組TIMP- 1和Ⅰ型膠原蛋白表達與同一時間點的C1組和T3組比較無明顯不同(P>0.05)。(圖3、4，表4、5)

圖3 給予BLM后第1、3天進行基因轉染TIMP-1蛋白的表達(×400)Fig 3 Lung protein expression of TIMP-1 after being transfected following the intratracheal injection of BLM on days 1, 3 (×400)

圖4 給予BLM后第1、3天進行基因轉染Ⅰ型膠原蛋白的表達(×400)

表4 不同時間肺組織中TIMP-1蛋白表達的變化Tab 4 Lung TIMP-1 protein expression at different time-points

T1(正義TIMP-1轉染組)、T2(反義TIMP-1轉染組)、T3(空載體轉染組)、C(正常對照組)、C1(肺纖維化組)；1)與同一時間點C1組及T3組比較，P<0.05；2)與C組比較，P<0.05

表5 不同時間肺組織中Ⅰ型膠原蛋白表達的變化Tab 5 Lung type I collagen protein expression at different time-points

T1(正義TIMP-1轉染組)、T2(反義TIMP-1轉染組)、T3(空載體轉染組)、C(正常對照組)、C1(肺纖維化組)；1)與同一時間點C1組及T3組比較，P<0.05；2)與C組比較，P<0.05

3 討 論

氣管內注射BLM的方法制作肺纖維化模型是研究肺纖維化的經典模型，被廣泛應用[9]。目前，已經有學者將構建好的反義TIMP-1真核細胞表達質粒,以脂質體包埋后將其導入大鼠肝、腎纖維化模型內并獲得有效表達,結果發現纖維化程度明顯減輕[10-15]。本研究的前期工作發現肺纖維化與TIMP-1有明確的相關性，并以逆轉錄病毒為載體成功地在體外將正義及反義的TIMP-1基因轉染至小鼠的成纖維細胞獲得高效表達，證實反義TIMP-1轉染可抑制成纖維細胞增殖、使內源性TIMP-1表達下降，MMPs活性增加，降低培養基中的ECM含量。正義TIMP-1基因作用相反，但是此過程中MMPs的表達量并無變化[16]。

在前期工作的基礎上本研究利用正、反義基因轉染動物模型，在體內探討TIMP-1基因在肺纖維化中的作用。病理形態學上發現第1、3天正義、反義TIMP-1轉染組與同一時間點的肺纖維化組、空載體轉染組比較，正義組纖維化程度嚴重，纖維組織增加及膠原沉積更明顯，反義組相反，且發現給藥后第3天進行正反義TIMP-1表達質粒轉染作用最明顯。余正、反義TIMP-1轉染組與同一時間點的肺纖維化組、空載體轉染組差異比較無顯著性意義。說明給藥后第1、3天進行反義TIMP-1基因轉染可以使纖維化程度減輕，且第3天轉染作用更顯著。本研究還分別從基因和蛋白水平對反義TIMP-1表達質粒的治療作用進行評估，結果顯示第1、3天反義TIMP-1轉染組與同一時間點的肺纖維化組、空載體轉染組比較內源性TIMP-1表達下降， 細胞外基質成分I型膠原表達下降，與前期工作體外實驗結果相一致。

TIMPs的表達變化直接影響MMPs的活性，進而影響細胞外基質成分的變化，再結合轉染后病理形態學變化，因此認為反義轉染后內源性TIMP-1表達下降，可能通過增加MMPs的活性而促進細胞外基質的降解，使纖維化程度明顯減輕，并不影響MMPs表達量的變化。且纖維化早期成纖維細胞分裂增加，而逆轉錄病毒載體僅能感染有絲分裂期的細胞[17]，此時轉染效率高，作用顯著。同時本研究發現反義轉染后TIMP-1表達仍高于正常對照組，說明肺纖維化的發展受多種因素影響，生長因子，細胞因子，化學增活素和凋亡調節劑被認為與這個過程有關[18]。單一某個因素的作用不能完全阻止肺纖維化的發生，反義TIMP-1表達質粒基因轉染僅能在一定程度上抑制肺纖維化的發展，但是并不能逆轉肺纖維化的發生。纖維化后期無明顯治療作用，主要考慮在后期膠原已經沉積，處于有絲分裂期的細胞減少，轉染效率低至無所致。說明反義TIMP-1基因轉染對已形成的肺纖維化無顯著作用，故給藥后第7～90天進行反義TIMP-1基因轉染不能逆轉已發生的肺纖維化。如果改變基因治療中的載體是否會有更好的治療效果還需進一步探討。

肺纖維化的發病率逐年升高，然而，尚無有效的治療方法。本研究利用基因轉染技術將正義及反義TIMP-1成功地轉染到博來霉素誘導的肺纖維化大鼠模型肺內，并獲得高效表達。結果表明給予BLM后第1、3天進行反義TIMP-1基因轉染使其內源性的TIMP-1的表達受到抑制，在一定程度上抑制肺纖維化的發生，為TIMP-1反義核酸治療肺纖維化提供實驗基礎。

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