仙靈骨葆對去勢大鼠腰椎軟骨終板退變的預防作用

張勝強，孫倩

（河北省唐山市唐?？h醫院骨二科，河北 唐山 063299）

仙靈骨葆對去勢大鼠腰椎軟骨終板退變的預防作用

張勝強，孫倩

（河北省唐山市唐海縣醫院骨二科，河北 唐山 063299）

目的 探討仙靈骨葆預防去勢大鼠腰椎軟骨終板退變的作用機制。方法 30只3月齡Sprague-Dawley（SD）大鼠，隨機均分為3組，每組10只：雙側卵巢切除（OVX）手術組；手術對照組（Sham組）；雙側卵巢切除+仙靈骨葆組（OVX+XLGB組），3組術后三個月處死，常規組織切片，HE常規染色、番紅0-固綠特殊染色測量軟骨終板血管芽相對面積及運用免疫組化檢測軟骨終板MMP-13的表達。結果 OVX組大鼠椎間盤MMP-13表達及軟骨終板血管芽相對面積減少顯著高于Sham組和OVX+XLGB組（P<0.05）；Sham組顯著低于OVX+XLGB組（P<0.05）。結論 仙靈骨葆可能通過降低軟骨內MMP-3表達量、增加終板血管芽相對面積，延緩椎間盤的退變.

卵巢切除；軟骨終板退變；免疫組化；仙靈骨葆

研究證實，軟骨終板在椎間盤退變的病理過程中最早出現退變，血管芽面積和椎間盤退變密切相關[1]。仙靈骨葆由淫羊藿、續斷、補骨脂、知母、丹參等組成的補腎壯骨藥物，主要用于骨質疏松的治療。目前，國內外尚無有關XLGB對軟骨終板退化及退化過程中表達的相關因子影響的報道，因此本實驗通過OVX大鼠建立骨質疏松（OP）模型，并通過對椎體和椎間盤軟骨終板組織學、形態學及相關因子表達的研究，探討XLGB對椎間盤退變的預防作用機制，為臨床治療提供理論依據.

1 材料和方法

1.1 動物模型的建立和實驗方案

健康3月齡雌性Sprague-Dawley大鼠30只，體重220±28 g（河北聯合大學實驗動物中心，Ⅱ級）隨機分為3組，每組10只：雙側卵巢切除組（OVX組）；單純手術對照組（Sham組）；雙側卵巢切除+仙靈骨葆治療組（OVX+XLGB組）。利用10 ml/L戊巴比妥鈉（40 mg/Kg）腹腔注射麻醉，在無菌條件下20只大鼠行背部入路雙側卵巢切除手術，10只大鼠暴露卵巢但不切除．仙靈骨葆治療組（XLGB組）術后第二天仙靈骨葆灌胃（270 mg/kg/d），Sham組和卵巢切除組（OVX組）大鼠按以上方法皮下注射生理鹽水。3個月后處死大鼠取 L4-L5椎體及椎間盤置于10%福爾馬林中性緩沖液中準備HE常規染色、特殊染色及免疫組化。

1.2 免疫組化步驟

石蠟切片60℃烤箱烘烤20 min，常規脫蠟至水。PBS液漂洗3次，每次3 min。復合酶在室溫下對組織抗原修復15 min。每張切片滴加3%H2O2室溫下孵育10 min，PBS沖洗3次，每次3 min。除去PBS，滴加一抗（1：100，室溫下孵育 60 min 或者 4℃過夜。PBS沖洗3次，每次5 min。除去PBS后每張切片滴加50 ul酶二抗聚合物，室溫下孵育40 min或者4℃過夜。PBS沖洗3次，每次3 min。除去PBS液，每張切片滴加50 ul新鮮配置的DAB溶液，顯微鏡下觀察，適時終止自來水沖洗3 h，蘇木素復染min，0.5%鹽酸酒精分化10 s，自來水沖洗30 min，PBS返藍。切片經梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。陰性對照用PBS代替Ⅰ抗。利用半定量方法測定灰度值。

1.3 番紅O-固綠染色

石蠟切片烘烤后常規脫蠟至水，入蘇木素染液5 min，自來水沖洗，0.5%鹽酸酒精液經10 s分色，氨水中返藍，自來水沖洗3 min。入0.02%固綠溶液3 min。0.1%醋酸洗片，入0.1%的番紅染液30 min。切片經梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.4 椎體軟骨終板血管芽相對面積測量

取HE染色切片，用德國Leika顯微鏡觀察軟骨終板下血管形態和數目，在HEX 100的顯微鏡下分別計數4個事業并取平均值，結果以x±s表示。

1.5 統計方法

各組大鼠所有參數均以均數±標準差表示（x±s）。資料用 SPSS（V11．0）來分析，利用 Student’s t檢驗來比較各組之間的顯著性差異。P<0.05被認為有顯著性差異。

2 結果

2.1 組織學表現

Sham組大鼠椎間盤骺板和關節軟骨終板軟骨細胞排列規則，血管芽豐富。OVX組大鼠椎間盤骺板和軟骨終板變薄，軟骨細胞數量減少，排列紊亂，在靠近次級骨化中心的軟骨終板和骺板鈣化，甚至完全骨化，軟骨終板和髓核之間的過渡區（transitional zone）被許多小軟骨細胞所取代。髓核脊索細胞數量進一步下降，出現大量團塊狀的軟骨樣細胞，髓核粘液變、裂隙生成。纖維環后部結構排列紊亂，厚度變薄，間隙增寬。血管芽數目減少，腔隙較小，周圍鈣化．XLGB組大鼠椎間盤髓核內脊索細胞及血管芽數目較Sham組大鼠下降，但明顯多于OVX組的大鼠，軟骨終板的鈣化和后部纖維環的紊亂程度較OVX組大鼠也明顯減輕。（見圖1、表1）

表1 各組軟骨終板血管芽相對面積（x±s）

2.2 免疫組織化學結果

2.2.1 光鏡下觀察結果：MMP-13蛋白的表達在胞漿，呈棕黃色顆粒狀，OVX組的表達明顯高于SHAM組和OVX+XLGB組，OVX+XLGB組的表達高于SHAM組.（見圖2、表2）

圖1 軟骨終板（番紅O-固綠染色×10）

圖2 MMP-13的表達（SP法ⅹ10）

表2 各組MMP-13灰度值比較

注：△P<0.05，vs Sham 組，*P<0.05，vs OVX 組

3 討 論

椎間盤是一個無血管組織，營養主要通過軟骨終板及纖維環兩個途徑被動擴散而來，軟骨終板途徑是主要途徑，Hassler[2]發現隨著退變的加重，終板血管芽發生改變，導致椎間盤營養障礙。本研究發現，OVX組大鼠腰椎間盤發生嚴重退變，表現在椎間盤髓核脊索細胞數量減少，出現軟骨樣細胞，髓核粘液變、裂隙生成，軟骨終板變薄，軟骨細胞數量減少、鈣化，甚至完全骨化，纖維環后部結構排列紊亂，厚度變薄，間隙增寬，椎體邊緣骨贅增生，血管芽分布不均，管壁粗糙不平。XLGB組大鼠也呈現一定程度的椎間盤退變，但程度明顯減輕。這表明仙靈骨葆有助于延緩腰椎間盤退變。

MMP-13主要來源于軟骨細胞，主要降解Ⅱ型膠原。MMP-13對Ⅱ型膠原的催化效率大概是MMP-1對Ⅱ型膠原催化效率的5倍，是椎間盤退變的重要因子。研究證實[3、4]椎間盤退變模型中，MMP-13表達水平有明顯的增加。本實驗結果表明：OVX大鼠軟骨終板中MMP-13的蛋白表達較其他組明顯增高，證實了MMP-13在椎間盤退變作用中的作用。

仙靈骨葆由淫羊藿、續斷、補骨脂、知母、丹參等組成的補腎壯骨藥物，淫羊藿可以促進成骨細胞的分化及礦化功能，誘導破骨細胞凋亡，抑制骨吸收，并促進骨髓基質細胞向成骨細胞分化[5]，用于骨質疏松的治療。丹參有活血通絡，養血止痛的作用，可以改善微循環和血流速度，減輕血管內炎癥細胞的滲出，研究證實[6]仙靈骨葆有增加雌激素的作用，雌激素可以抑制IL-1b、TFN-a等負向炎癥介質的表達，IL-1是MMP-13的有效誘導劑，IL-1使處理過的椎間盤細胞中MMP-13的基因表達增強，Ⅱ型膠原基因表達下降[7.8]，仙靈骨葆可能通過抑制IL-1的表達抑制MMP-13的表達，但具體的信號途徑還有待進一步研究。

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Treatment with Xianglinggubao（XLGB） suppresses lumbar intervertebral cartilage endplate in ovari ectomized rats

ZhANG sheng-qiang，SUN Qian
（Department of Orthopedics，The Tan Hai Hospital of Tangshan Hebei 063200，China）

ObjectiveTo investigated the effects of Xianglinggubao on vertebral cartilage endplate degeneration in the OVX rats．MethodsThirty 3-month-old female Sprague-Dawley rats were randomized into three groups of ten animals each：Sham group；Xianglinggubao group；OVX group all rats were killed 3 months after surgery．HE、safranin O-fast green and immuno stained were used to evaluate the relative area of vascular buds and MMP-13 in the cartilage endplate.ResultsThe immunostained expression of MMP-13 and the relative area of vascular buds in the OVX group was higher than that in Sham group and OVX+XLGBgroup（P<0.05），the Sham group was lower than the OVX+XLGBgroup（P<0.05）。ConclusionXLGB probably protects articular cartilage by decreasing the expression levels of MMP-13 and increasing the relative area of vascular buds.

ovariectomy；cartilage endplate degeneration；immunohistochemistry；Xianglinggubao

R713.6；R687.3

A

1005-7324（2012）06-0422-03

2012-05-21；修訪日期：2012-06-13

河北省唐山市科技創新項目（ 111302046a）

張勝強（1974-），男，河北籍，副主任醫師，碩士

研究方向：骨質疏松與骨關節炎，

電 話：13933324066

電子信箱：zsq741105@163.com

·臨床研究·